不同復合應激致卵巢早衰大鼠的SRB1、CYP2E1蛋白表達水平比較*

穆拉迪力·約麥爾，納菲沙·卡德爾，阿卜力孜·克熱木，夏米西努爾·伊力克

（新疆醫科大學基礎醫學院，新疆 烏魯木齊 830054）

卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）指＜40歲女性因某種原因引起原發或繼發性閉經、卵泡生成受阻等卵巢整體功能受損[1-3]。中醫認為，在婦科病“外邪入侵”的眾多致病因素中，寒、濕、熱邪為主要原因，能夠傷及中焦陽氣，最終引起經絡不通、水液代謝異常[4]。SRB1蛋白在膽固醇代謝平衡中起關鍵作用，卵巢組織中SRB1的異常表達導致體內膽固醇代謝異常。CYP2E1基因表達上調引起細胞毒素代謝增加，導致活性氧大量合成，最終卵巢功能受損[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

通過陰道涂片篩選法（發情周期實驗）選取性成熟的50只健康Wistar雌性大鼠（由新疆醫科大學實驗動物中心提供），體重（180±30）g。適應性飼養1周后，由于理論造模時間相差較大，隨機分為POF組（A組）、熱邪復合應激模型組（B組）、正常對照第1組（N1組），以及寒邪復合應激模型組（C組）、正常對照第2組（N2組）。各組10只大鼠。A組、B組、N1組模型復制時間10 d；C組、N2組模型復制時間21 d。

1.2 主要試劑及儀器

RXZ型人工氣候箱（寧波市新江南儀器有限公司），兔多克隆抗體CYP2E1、兔單克隆抗體SRB1購自美國Abcam公司，順氯氨鉑（美國Sigma公司），大麥、芫荽籽、黑胡椒、干姜、西紅花。

1.3 方法

1.3.1 POF大鼠模型的復制 按照LI等[6]的方法，將1.5 mg/kg順氯氨鉑稀釋于1 ml生理鹽水，每天下午2：00行腹腔注射，連續10 d。在（20±3）℃、相對濕度（relative humidity, RH）55%～65%條件下飼養大鼠。

1.3.2 中醫寒邪復合應激致POF動物模型的復制 在楊宇琦等[7]報道的模型基礎上做適當調整，采用干寒飼養環境[人工氣候箱：（6±2）℃、RH 25%～35%，12 h/次，1次/d]，干寒屬性飼料（大麥、芫荽籽）飼養。同時予以間斷性足底電刺激、制動，冷水中強迫游泳等多因素復合作用，產生慢性應激，持續3周。

1.3.3 中醫熱邪復合應激致POF動物模型的復制

按照中醫“熱邪”證候特點[8]，結合寒邪模型復制方法，采用干熱飼養環境[人工氣候箱：（26±2）℃、RH 25%～35%，12 h/次，1次/d]，干熱屬性飲水（1 g西紅花浸泡于500 ml雙蒸水），干熱屬性藥物灌胃（30.0 g黑胡椒、30.0 g干姜、0.3 g西紅花溶解于500 ml雙蒸水，按2 ml/100 g體質量灌胃，1次/d）。同時予以間斷性足底電刺激、夾尾、噪音等多因素復合作用，產生體內刺激，持續10 d。

1.3.4 正常對照組 大鼠在（20±3）℃、RH 55%～65%條件下飼養，自由飲食。各組大鼠12 h晝/夜循環照明，定時觀測生物學表征變化。

1.3.5 觀察指標 模型復制成功后用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，取卵巢組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片。

1.3.6 免疫組織化學法 每個樣本隨機選取10個視野，并保證各視野間完全不重疊。采用陽性細胞計數法，每組取7～10個不同樣本，進行組間比較。陽性范圍指陽性細胞所占百分率，分為5個等級：陽性范圍＜5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；著色強度指陽性細胞染色程度，分為4個等級：幾乎不著色或有一點著色為0分，著色較淺為1分，著色較深為2分，著色很深為3分，最終得分=陽性范圍評分×著色強度評分×25。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠SRB1蛋白表達水平比較

SRB1蛋白在卵巢組織的黃體細胞、卵泡膜細胞、細胞質中呈陽性表達，在細胞核和顆粒層細胞中呈陰性表達。N1組、N2組、A組、B組、C組大鼠的SRB1蛋白相對表達量分別為（92.86±34.50）、（97.22±44.10）、（246.88±73.72）、（200.00±35.36）、（182.14±40.09），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=18.734，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，各模型組卵巢組織中SRB1蛋白表達水平較正常對照組升高（P＜0.05）；其中A、B組較N1組卵巢組織中SRB1蛋白表達變化率分別為166%和115%，差異有統計學意義（P=0.000）；C組較N2組卵巢組織中SRB1蛋白表達變化率為87%，差異有統計學意義（P=0.000）；A組與B組、A組與C組卵巢組織中SRB1蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組與C組卵巢組織中SRB1蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、2。

圖1 SRB1在各組大鼠卵巢組織中的表達 （×100）

圖2 各組大鼠卵巢組織中SRBI表達水平比較 （±s）

2.2 各組大鼠CYP2E1蛋白表達水平比較

CYP2E1蛋白在卵巢組織的黃體細胞、卵泡膜細胞、顆粒層細胞、細胞漿中呈陽性表達，在卵泡間質細胞中呈陰性表達。N1組、N2組、A組、B組、C組大鼠的CYP2E1蛋白相對表達量分別為（106.25±60.87）、（108.33±43.30）、（265.63±64.00）、（201.00±35.36）、（182.14±104.80），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=10.198，P=0.001）進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，各模型組卵巢組織中CYP2E1表達水平較正常對照組升高（P＜0.05）；其中A、B組較N1組卵巢組織中CYP2E1蛋白表達變化率分別為150%和89%，差異有統計學意義（P=0.000）；C組較N2組卵巢組織中CYP2E1蛋白表達變化率為68%，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組與B組、A組與C組卵巢組織中CYP2E1蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組與C組卵巢組織中CYP2E1蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 3、4。

圖3 CYP2E1在各組大鼠卵巢組織中的表達 （×100）

圖4 各組大鼠卵巢組織中CYP2E1表達水平比較 （±s）

3 討論

隨著社會快速發展，引起POF的因素諸多，包括遺傳因素、自身免疫、感染情況等[9]。由于POF病因復雜，尚無有效的治療方法。西醫多采用激素替代療法（hormone replacement therapy, HRT）和促排卵療法，即給予相應激素以補充機體雌激素不足[10-11]。HRT療法具有療程長、毒副作用強等特點，使患者患心臟病、子宮內膜癌等惡性疾病的風險加大。中醫學者認為，腎虛是POF的病理學基礎，病變涉及心、肝、脾、肺等器官，肺臟在婦科疾病的診療中經常被忽略，但肺與腎組織關系密切，肺陰虛損，亦可致腎陰不足。由于中醫實驗動物研究起步晚，不同中醫體質異常所致的POF動物模型尚未成功復制，其生物學基礎與發病機制需進一步從現代醫學的角度進行研究。

SRB1是位于細胞表面的一種受體糖蛋白，分布廣泛，主要在肝臟、腎上腺、卵巢等能生成類固醇激素的組織中高度表達。SRB1可以結合未被修飾過的LDL、VLDL等配體，對HDL有高親和力，在HDL代謝中發揮關鍵作用。在細胞外膜上，SRB1能夠調節疏水脂蛋白中脂類物質的選擇性攝取，既能介導肝臟對HDL中膽固醇脂的選擇性攝取，又能促進外周組織細胞內游離膽固醇轉運至HDL，從而保持膽固醇代謝的平衡[12]。因此，POF的發生可能與體內膽固醇代謝有關，膽固醇代謝異常可能是熱邪、寒邪導致POF的原因。CYP2E1是CYP450酶系中重要的亞型，在乙醇代謝中起關鍵作用。在高濃度乙醇條件下，隨著CYP2E1蛋白表達上調，細胞毒素代謝增加，產生大量活性氧，引起氧化應激，導致細胞死亡[13]。CYP2E1升高還可引起炎癥反應加重，可以級聯引發其他炎癥因子的活性升高，促進其他炎癥因子表達。POF的發生還可能與細胞內有毒物質、活性氧，以及炎癥因子的過度產生有關。

本研究結果表明，SRB1、CYP2E1蛋白在POF，以及熱邪、寒邪復合應激模型大鼠卵巢組織中的表達水平有不同程度變化，POF組表達最高，其次為熱邪和寒邪復合應激大鼠模型組，模型組與正常對照組有差異。寒邪、熱邪復合應激模型與POF的發生關系密切。熱邪、寒邪所致POF可能與體內膽固醇代謝異常及活性氧等物質的產生有關。