乳腺癌組織中Snail、Bcl-2的表達水平及其臨床意義

劉平賢，張浩，李偉漢

（河南省南陽市中心醫院，河南 南陽 473009）

據有關數據顯示，每年約120萬女性確診為乳腺癌，死亡人數約45萬，乳腺癌已成為威脅全球女性健康最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前，手術切除仍然是治療乳腺癌的主要手段，基于組織病理學診斷結果不僅有助于了解患者的病理特征，而且有利于對患者預后進行準確判斷。但是臨床資料顯示，相同病理結果患者其治療及預后差異較大。有文獻報道稱，由于乳腺癌的高度異質性，即使存在完全相同的組織形態學結構，其分子遺傳內容的改變也未必相同，這可能是患者治療效果差異的原因之一[2]。探討與浸潤、轉移及無限增殖有關的蛋白分子改變具有重要意義。研究發現，Snail可調節腫瘤細胞上皮間質化，促進細胞轉移[3]。B淋巴細胞白血病-2（B-cell lymphorma-2,Bcl-2）基因是腫瘤細胞重要的抗凋亡基因[4]。但是目前關于Snail與Bcl-2是否存在一定關系的報道較少。因此，本研究通過分析2010～2015年在河南省南陽市中心醫院治療并有完整隨訪記錄的患者的病理特征及預后，結合Snail和Bcl-2蛋白表達水平，為進一步了解乳腺癌的發病機制，探索新的治療方法提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年4月-2015年5月于本院實施手術切除的92例乳腺癌患者作為研究對象，獲取乳腺癌石蠟組織標本92例，癌旁組織標本92例，癌旁組織距手術邊緣＞3 cm。根據TNM分期標準，Ⅰ、Ⅱ期57例，Ⅲ期35例。根據腫瘤組織分化情況，中、高分化50例，低分化42例。納入標準：①病理結果顯示浸潤性導管癌；②術前未放化療；③近3個月內未服用激素類藥物；④完整的病例資料及隨訪記錄。排除標準：①合并有其他腫瘤；②生存期＜3個月；③存在糖尿病等慢性消耗性疾病。患者的病理資料中，如乳腺癌組織類型雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）、ki-67及人類表皮生長因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2,Her-2）免疫組織化學結果均由本院高年資病理醫師給出。本研究經本院倫理委員會批準，患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人Snail單抗、兔抗人Bcl-2單抗及羊抗兔多抗（英國Abcam公司），二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司），免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），Ti型熒光顯微鏡（上海尼康儀器有限公司），TC-150型自動脫水機、TB-718型自動包埋機及TK-218V恒溫攤片機型（孝感市湖北泰維醫療科技有限公司）。

1.3 免疫組織化學法

病理組織經10%甲醛固定、脫水、透明及透蠟后進行石蠟包埋、切片，厚5～6μm，依次進行脫蠟、復水、抗原修復、滅活過氧化氫酶及封閉步驟后，分別加入Snail單抗（1∶30稀釋）或Bcl-2單抗（1∶50稀釋），37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌后加入羊抗兔多抗（1∶1 000稀釋），37℃孵育1 h，PBS洗滌后加入辣根過氧化物，37℃孵育10～20 min，PBS洗滌后加入DAB顯色液，自來水沖洗并進行蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。以PBS為抗體陰性對照。

1.4 免疫結果判斷

由于Snail和Bcl-2均表達于細胞質中，免疫組織化學法結果可顯示棕黃色或棕褐色。結果由2位未直接參與本研究的病理醫生在雙盲情況下閱片，根據陽性細胞數目和染色程度進行評分：①陽性細胞數≤5%計0分，＞5%～25%計1分，＞25%～50%計2分，＞50%～75%計3分，＞75%～100%計4分；②染色程度:未見陽性細胞計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最終得分=陽性細胞數目得分×染色程度得分，得分＜5分為低表達，≥5分為高表達。患者Snail高表達60例，低表達32例；Bcl-2高表達39例，低表達53例。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計學分析，計數資料以率（%）或構成比表示，比較用χ2檢驗，生存曲線分析采用Kaplan-Meier法中的Log-rank χ2檢驗，相關性分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中Snail與Bcl-2蛋白表達水平

乳癌癌組織中Snail高表達率為62.5%（60/92），Bcl-2低表達率為57.6%（53/92），癌旁組織中Snail高表達率為39.1%（36/92），Bcl-2低表達率為34.8%（32/92），兩者的Snail和Bcl-2表達率比較，差異有統計學意義（χ2=12.554和9.643，P=0.014和0.046），乳腺癌組織中Snail與Bcl-2表達水平呈負相關（r=-0.519，P=0.021）。見圖 1。

圖1 乳腺癌及癌旁組織中Snail與Bcl-2的表達情況

2.2 Snail表達水平與臨床病理特征的相關性

Snail表達水平與病理分期、腫瘤大小及HER-2無相關性（P＞0.05），與組織學分級、淋巴結是否轉移、雌激素受體（estrogen receptor, ER）及孕激素受體（progesterone receptor, PR）表達有相關性（P＜0.05）。見表1。

表1 Snail表達水平與臨床病理特征的相關性

2.3 Bcl-2表達水平與臨床病理特征的相關性

Bcl-2表達水平與病理分期、組織學分級、淋巴結轉移及HER-2表達無相關性（P＞0.05），與腫瘤大小、ER及PR有相關性（P＜0.05）。見表2。

表2 Bcl-2表達水平與臨床病理特征的相關性

2.4 Snail對乳腺癌患者預后的影響

低表達Snail乳腺癌患者中，骨轉移2例，肝轉移2例，無瘤生存率為87.5%（28/32）；高表達Snail乳腺癌患者中，骨轉移3例，肺轉移2例，腦轉移2例及肝轉移6例，無瘤生存率為78.3%（47/60），兩者無瘤生存率比較，差異有統計學意義（χ2=4.553，P=0.042）。低表達Snail患者死亡1例，高表達Snail患者死亡5例，兩者生存率比較，差異有統計學意義（χ2=5.642，P=0.036）。見圖2。

圖2 高、低表達Snail患者的生存曲線

2.5 Bcl-2對乳腺癌患者預后的影響

高表達Bcl-2乳腺癌患者中，骨轉移2例，肝轉移3例，無瘤生存率為87.2%（34/39）；低表達Bcl-2乳腺癌患者中，骨轉移3例，肺轉移2例，腦轉移2例，肝轉移5例，無瘤生存率為77.4%（41/53），兩者無瘤生存率比較，差異有統計學意義（χ2=6.542，P=0.032）。低表達Bcl-2患者死亡5例，高表達Bcl-2患者死亡1例，兩者生存率比較，差異有統計學意義（χ2=7.215，P=0.028）。見圖3。

圖3 高、低表達Bcl-2患者的生存曲線

3 討論

臨床數據顯示，目前我國乳腺癌發病率已位居女性癌癥第1位，其發病率約為萬分之四，且每年以3%的速度逐年增加，并呈現年輕化趨勢[5]。而隨著對乳腺癌發病機制的深入了解以及分子診斷學技術的發展，已證實乳腺癌術后復發與轉移可受到腫瘤微環境、機體免疫功能及遺傳等多因素調節，并涉及多基因及多條信號通路。其中Snail與Bcl-2是目前研究乳腺癌轉移及復發的重要調控因子。由于Snail可通過上調波形蛋白、成纖維細胞特異蛋白和Rho蛋白表達或下調鈣粘附蛋白E表達等途徑導致腫瘤上皮間質化并促進腫瘤轉移的發生，因而Snail高表達往往意味著腫瘤轉移風險較大，且患者預后不良[6]。Bcl-2蛋白則與Bax蛋白同時表達于正常的乳腺上皮細胞，且兩者表達水平處于動態平衡中，但乳腺癌組織中多呈現Bcl-2過表達[7]。由此筆者推測Bcl-2/Bax失衡或將導致機體無法及時清除變異的異常細胞，從而為腫瘤的形成或復發提供條件。而采用藥物抑制Bcl-2蛋白活性，誘導腫瘤凋亡并最終起到殺死腫瘤細胞便是根據Bcl-2的作用機制。

由于腫瘤增殖及轉移在一定程度上或許存在某種聯系，而以往研究中又多將Snail與Bcl-2作為研究腫瘤轉移的重要調控基因或關鍵的藥物靶點，較少涉及到兩者相關性或兩者與腫瘤病理特征及預后關系。但深入了解以上問題，不僅有利于對藥物治療效果的正確評價，還有助于提前制定合理的治療手段，從而提高乳腺癌治療效果及生存率。因此，本研究首先針對乳腺癌組織及癌旁組織中Snail及Bcl-2的表達水平差異進行分析。其結果顯示，Snail及Bcl-2在不同組織中的表達水平有差異，且Snail與Bcl-2表達水平在乳腺癌組織中呈現負相關性。研究顯示，鈣黏附蛋白E是腫瘤上皮間質化的直接調控蛋白，而低分化、高惡性程度的腫瘤組織中往往低表達鈣黏附蛋白E，且Snail又可負性調節鈣黏附蛋白E，因而，高表達Snail的腫瘤組織或許易發生腫瘤上皮間質化及腫瘤轉移[8]。但是，作為抗凋亡基因Bcl-2，雖然其在乳腺癌組織及癌旁組織中表達存在差異，但Bcl-2在乳腺癌組織并非高表達，而SMERAGE等也證實，高表達Bcl-2與患者預后具有正相關性[9]。其可能原因是Bcl-2不僅抑制細胞凋亡，也延緩了細胞周期及分裂次數，從而對細胞增殖產生負性作用[10]。而這或許解釋了Snail與Bcl-2存在負相關性的可能性之一，即細胞增殖或許有利于細胞上皮間質化的發生[11]。

隨后，本研究按臨床病理特征對乳腺癌患者分組，并探討不同情況分組下Snail與Bcl-2的表達情況。其結果顯示，Snail與組織學分級、淋巴結轉移與否以及ER、PR表達存在相關性。由于Snail與腫瘤細胞侵襲能力存在正相關性，而病理分期則是以癌組織浸潤程度為判斷依據之一，而癌組織浸潤程度越高，其發生癌細胞轉移的幾率也大大增加，因而也更易出現淋巴結轉移。此外，三陰性乳腺癌（ER-/PR-/HER-2-）具有侵襲性強、癌細胞易轉移及預后較差等特點，而從本研究結果可知，Snail與ER及PR均存在負相關性，但Snail與HER-2無明顯相關性，基本與以往報道相符合[12]。其可能存在機制為內分泌激素影響腫瘤微環境，從而對Snail調節鈣黏附蛋白E通路產生影響[13]。此外，Bcl-2與腫瘤大小、ER及PR存在相關性。由于腫瘤變大多伴隨腫瘤細胞大量增殖，而此類癌細胞多低表達或不表達Bax，而高表達Bcl-2[14]。MARTIN等[15]研究發現Bcl-2高表達患者多為ER+或/和PR+，但其具體作用機理仍有待進一步分析。另外，高表達Snail或低表達Bcl-2患者的無瘤生存期及生存率均低于低表達Sanil或高表達Bcl-2患者。結合其病理特征分析，筆者猜測如下原因：①Snail低表達及Bcl-2高表達多為雌/孕激素受體陽性患者，而這類患者進行內分泌治療效果較好；②病理早期、未發生淋巴轉移或腫瘤較小患者采取手術治療效果較好。

綜上所述，Snail及Bcl-2不僅存在一定負相關性，且在一定程度上均可反應患者病理特征及其預后，不僅可作為治療乳腺癌的藥物靶點，也可作為乳腺癌的診斷指標之一。但鑒于本研究納入樣本數較少，后續還需進行多樣本，隨機雙盲實驗，以便獲得更加可信的結論。