針刺對血管性癡呆大鼠前額葉皮層炎癥水平的影響

楊靜雯　林麗婷　李天然

摘要：目的 觀察針刺對血管性癡呆大鼠前額葉皮層Toll樣受體4（TLR4）表達及下游炎癥因子白細胞介素（IL）-1β和IL-6表達的影響，探討針刺的腦保護作用。方法 50只大鼠隨機分為假手術組、模型組、針刺組和非穴組。采用雙側頸總動脈永久性結扎方法制作血管性癡呆大鼠模型。造模后第3日針刺干預，每日1次，共2周。采用Morris水迷宮實驗評價大鼠空間學習記憶能力，免疫組化檢測小膠質細胞標志物離子鈣結合蛋白1（Iba1）及TLR4表達，RT-PCR檢測炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達。結果 與假手術組比較，模型組大鼠空間學習記憶能力降低，前額葉皮層Iba1、TLR4及IL-1β、IL-6表達升高；與模型組比較，針刺組大鼠空間學習記憶能力改善，前額葉皮層Iba1、TLR4及IL-1β、IL-6表達降低；非穴組無明顯改善。結論 針刺可抑制血管性癡呆大鼠前額葉皮質小膠質細胞激活，降低TLR4及其下游炎癥因子表達水平，改善大鼠空間學習記憶能力。

關鍵詞：血管性癡呆；針刺；小膠質細胞；Toll樣受體4；炎癥反應；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.012

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0048-05

Effects of Acupuncture on Inflammation in Prefrontal Cortex of Vascular Dementia Rats

YANG Jing-wen1， LIN Li-ting1， LI Tian-ran1， ZHANG Shuai1， WANG Xue-rui1， LIU Cun-zhi2

1. Beijing Hospital of TCM Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China；

2. Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on TLR4， inflammation factors IL-1β and IL-6 expressions in the prefrontal cortex of vascular dementia （VD） rats； To investigate the brain protective mechanisms of acupuncture. Methods A total of 50 rats were randomly divided into sham-operation group， model group， acupuncture group， and placebo-acupuncture group. The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion （2VO） in rats. Acupuncture was performed at three days after surgery， once daily for two weeks. Morris water maze was used to test the cognitive function. The expressions of Iba1 and TLR4 were assessed by immunohistochemical method. Inflammation factors IL-1β and IL-6 mRNA expressions were tested by RT-PCR. Results Compared with sham-operation group， the model group rats showed impaired spatial learning and memory ability， and expression of Iba1， TLR4， and IL-1β， IL-6 increased. Compared with the model group， the spatial learning and memory abilities of the acupuncture group were improved， and the expression of Iba1， TLR4 and IL-1β， IL-6 in the prefrontal cortex decreased. These effects were not found in the placebo-acupuncture group. Conclusion The effect of acupuncture may be achieved by inhibiting microglia activate， decreasing the expressions of TLR4， IL-1β and IL-6 in the prefrontal cortex， resulting in improving spatial learning and memory ability of VD rats.

Keywords： vascular dementia； acupuncture； microgila； TLR4； inflammation； rats

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指各種腦血管疾病引起的大腦功能障礙而產生的一種慢性進行性獲得性認知功能損害綜合征。研究表明，炎癥反應在慢性腦缺血后繼發性神經損傷中起重要作用[1-2]。小膠質細胞是中樞神經系統中炎癥發生的主要細胞，在免疫應答過程中起關鍵作用。Toll樣受體（TLRs）是一組典型的內源性免疫反應的識別受體，國外研究顯示，TLRs家族參與了神經炎癥及癡呆的進程，Toll樣受體4（TLR4）介導了腦缺血炎性損傷[3]。近年來研究表明，針刺對VD有神經保護作用[4-7]。有報道，針刺可通過抑制腦缺血后的炎癥反應，調控炎性介質釋放，發揮神經保護作用[8]。本實驗觀察針刺對VD大鼠前額葉皮層TLR4表達及下游炎癥因子白細胞介素（IL）-1β和IL-6水平的影響，探討針刺的腦保護作用。

1 實驗材料

1.1 動物

10周齡SPF級健康雄性Wistar大鼠50只，體質量300～320 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養于恒溫（25±1）℃、相對濕度40%～60%環境，適應性飼養3 d。整個實驗過程符合動物倫理學標準。

1.2 主要試劑與儀器

PageRuler（美國Haoranbio公司），封閉用山羊血清（北京康為世紀公司），兔抗鼠Iba1一抗（美國Millipore公司），兔抗鼠TLR4一抗（美國Millipore公司），二步法抗兔/鼠通用型二抗試劑盒（上海基因科技有限公司），DAB顯色劑（北京中杉金橋公司），炎癥因子及β-actin mRNA引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。Morris水迷宮（美國CSI公司），離心機（美國Beckma公司），電子天平（美國sart & rius公司），冰凍切片機（德國Leica公司），BX51型光學顯微鏡（日本Olympus公司），RG-3000熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司），華佗牌0.30 mm×25 mm一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

采用雙血管阻斷方法復制VD模型[9]。2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，麻醉后切開頸部正中皮膚，剝離肌肉，充分暴露雙側頸總動脈，將血管與迷走神經用器械仔細分離，5-0絲線將雙側頸總動脈雙重絲線永久性結扎。假手術組除不結扎雙側頸總動脈外其他操作同手術組。造模后大鼠死亡10只，將造模成功大鼠隨機分為模型組、針刺組和非穴組，每組10只。

2.2 干預

造模后第3日開始針刺治療。取穴參照動物穴位圖譜[10]。取“百會”、雙側“足三里”，行捻轉補法（捻轉角度<90°，頻率>120次/min，持續30 s）。非穴組選取雙側肋下髂嵴上10 mm作為對照刺激點，行平補平瀉法（捻轉角度90～180°，每分鐘60～120次，持續45 s）。每日1次，治療6 d，休息1 d，共治療12次。假手術組和模型組分別行與針刺組和非穴組相同時間、相同程度的捉抓刺激。

2.3 Morris水迷宮實驗

水迷宮直徑160 cm，高 40 cm，水深30 cm，水溫（23±1）℃，池壁上4個等距離點分水池為4個象限，任選一象限在其中央放置平臺。平臺無色透明，直徑10 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍放置的參照物保持不變。測試5 d，每日4次。實驗時，操作者將大鼠隨機從4個不同象限放入水中，記錄大鼠游泳速度和逃避潛伏期。若60 s大鼠仍未找到平臺，則將大鼠放置在平臺上停留10 s，逃避潛伏期記錄為60 s。實驗第6日撤除平臺，觀察60 s內大鼠在池中平臺所在象限的時間。

2.4 取材及處理

末次針刺后第2日，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，大鼠麻醉后斷頭快速取出腦組織，分離前額葉皮層，-80 ℃冰箱保存。

2.5 RT-PCR檢測白細胞介素-1β、白細胞介素-6 mRNA表達

大鼠前額葉皮層組織用Trizol提取總RNA，用無RNA酶的DNA酶消化DNA雜質，紫外分光光度計測RNA OD260/280比值，檢測RNA純度。反轉錄合成cDNA，反應條件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min終止反應。擴增反應條件：95 ℃預變性2 min 后，變性（95 ℃ 10 s）、退火（60 ℃ 30 s）、延伸（70 ℃ 30 s）共40個循環，從70 ℃→95 ℃ 范圍內收集熒光信號，共10 min，得到融解曲線。以β-actin基因表達量作為RT-PCR產物的內參照，以Rotor-Gene6.0軟件收集循環閾值（Ct值，即每個反應管內熒光信號達到設定的閾值所需要循環數），目的基因相對mRNA表達用以下公式進行計算：目的基因相對mRNA表達=2-ΔΔCt，ΔCt=待測基因Ct值-管家基因Ct值。引物序列見表1。

2.6 免疫組化檢測離子鈣結合蛋白1、Toll樣受體4表達

室溫0.3%TritonX-100通透20 min，3%H2O2孵育20 min，滴加山羊血清封閉液，37 ℃孵育30 min，滴加一抗（1∶50），4 ℃過夜，滴加二抗，37 ℃孵育120 min。上述步驟間除羊血清外均用PBS洗3次，每次5 min。使用DAB顯色試劑盒室溫顯色，洗滌后蘇木素溶液復染，脫水封片。

3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析，組間多重比較方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett's T3。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 針刺對模型大鼠學習記憶能力的影響

與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，平臺所在象限時間顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，針刺組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，平臺所在象限時間顯著延長，差異有統計學意義（P<0.05），非穴組未見明顯差異；針刺組大鼠逃避潛伏期較非穴組顯著縮短，差異有統計學意義（P<0.05），針刺組大鼠平臺所在象限時間較非穴組顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖1、圖2。

4.2 針刺對模型大鼠前額葉皮層小膠質細胞的影響

與假手術組比較，模型組大鼠前額葉皮層小膠質細胞標記物離子鈣結合蛋白1（Iba1）陽性細胞數顯著增多（P<0.001）；與模型組比較，針刺組大鼠前額葉皮層Iba1陽性細胞數顯著減少，差異有統計學意義（P<0.01）；與非穴組比較，針刺組鼠前額葉皮層Iba1陽性細胞數顯著減少，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖3。

4.3 針刺對模型大鼠前額葉皮層Toll樣受體4表達的影響

TLR4免疫組化染色陽性表達產物呈棕黃色。與假手術組比較，模型組大鼠前額葉皮層TLR4著色較深，陽性細胞數顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，針刺組大鼠前額葉皮層TLR4陽性細胞數顯著降低（P<0.01）；與非穴組比較，針刺組大鼠前額葉皮層TLR4表達顯著降低（P<0.01）。結果見圖4。

4.4 針刺對模型大鼠前額葉皮層炎癥因子表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠前額葉皮層炎癥因子IL-1β和IL-6 mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，針刺組大鼠前額葉皮層IL-1β和IL-6 mRNA表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與非穴組比較，針刺組大鼠前額葉皮層炎癥因子IL-1β和IL-6 mRNA表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖5、圖6。

5 討論

目前，VD早期治療具有可逆性[11]。因此，研究其發病機制，尋找行之有效的治療方法是亟待解決的問題。腦血管病的病灶波及前額葉皮層，導致腦內炎癥反應的發生，繼而引起神經元損傷，使學習、記憶功能減退可能是VD的發病機制。本研究發現，針刺能抑制小膠質細胞激活，減少TLR4表達，降低大腦前額葉皮層炎癥水平，改善神經元損傷，從而提高VD大鼠學習記憶能力。

VD屬中醫學“呆癥”范疇，病位在腦，基本病機是肝腎精血不足，髓海空虛，痰瘀痹阻，神機失用。結合經絡理論，《難經·二十八難》云：“督脈者……上至風府，入屬于腦。”故針刺百會可提督醒腦。足三里屬足陽明胃經，脾胃為氣血生化之源，能夠運化營養物質營養全身及腦，有助于記憶的改善。本課題組前期研究發現，“足三里”“百會”作為VD動物研究中最常用的穴位，對改善VD大鼠學習記憶能力效果最顯著[5，12]。

海馬是與人類的學習記憶等高級功能有密切關系的重要功能區，對缺血低灌注損傷有易感性，被認為是與VD大鼠認知損害相關的主要腦區，但與認知功能密切相關的前額葉皮層在神經退行性疾病的病理過程中也有著潛在作用[13]。有研究顯示，針刺能改善大鼠海馬炎癥反應，發揮神經保護作用[14]，但是針刺對前額葉皮層的相關研究較少。

腦缺血后小膠質細胞介導的炎癥反應參與了VD的發生與發展。TLR4主要表達于小膠質細胞，可被多種內源性或外源性因子所激活，通過進一步激活下游的信號通路，參與小膠質細胞介導的神經炎癥反應[15]。目前的研究發現，TLR4依賴的小膠質細胞激活參與了多種神經免疫疾病及退行性疾病的慢性炎癥過程[16-17]。此外，近年研究發現，TLR4所介導的炎癥反應還參與了腦缺血性疾病的發生。Gao Y等[3]研究表明，TLR4可誘導中樞神經損傷，介導腦缺血炎性損傷。李瑩等[18]研究發現，TLR4 mRNA表達增加可能刺激腫瘤壞死因子-α（TNF-α）產生、分泌增多，從而參與介導腦梗死炎性損傷。本研究發現，針刺可通過抑制TLR4表達，緩解慢性腦低灌注導致的炎癥反應。

TLR4激活下游信號通路，導致一系列炎癥因子表達升高，促使白細胞趨化至損傷部位，引起神經元損傷，使動物的學習、記憶功能減退。Campbell I L等[19]研究發現，腦內高水平的IL-6可導致轉基因小鼠神經元退化并影響學習和記憶。陳秋欣等[20]研究發現，針刺可降低血清及血腫組織中TNF-α、IL-6的含量，減輕腦出血后繼發性損傷。本研究發現，針刺可降低VD大鼠大腦皮層炎癥因子IL-1β、IL-6的mRNA表達，從而改善大鼠學習記憶能力。

綜上，本研究以雙血管阻斷法建立的VD大鼠模型為研究對象，初步探討了針刺改善VD認知損害的炎癥機制。本研究結果從行為學觀察、炎癥調節因子TLR4表達及下游炎癥因子IL-1β、IL-6的mRNA表達3個方面，共同說明針刺“足三里”“百會”可抑制大腦前額葉皮層TLR4表達，降低炎癥因子IL-1β、IL-6的含量，從而改善VD大鼠的學習記憶能力，從機制上闡明針刺改善VD認知損害的可能靶點，為探討針刺治療VD提供了一定的依據。

參考文獻：

[1] WERSCHING H， DUNING T， LOHMANN H， et al. Serum C-reactive protein is linked to cerebral microstructural integrity and cognitive function[J]. Neurology，2010，74（13）：1022-1029.

[2] ZULIANI G， GUERRA G， RANZINI M， et al. High interleukin-6 plasma levels are associated with functional impairment in older patients with vascular dementia[J]. Int J Geriatr Psychiatry， 2007，22（4）：305-311.

[3] GAO Y， FANG X， TONG Y， et al. TLR4-mediated MyD88-dependent signaling pathway is activated by cerebral ischemia-reperfusion in cortex in mice[J]. Biomed Pharmacother，2009，63（6）：442-450.

[4] SHI G X， LI Q Q， YANG B F， et al. Acupuncture for vascular dementia：a pragmatic Randomized Clinical Trial[J]. Scientific World Journal，2015，2015：161439.

[5] YE Y， LI H， YANG J W， et al. Acupuncture attenuated vascular dementia-induced hippocampal long-term potentiation impairments via activation of D1/D5 receptors[J]. Stroke，2017，48（4）：1044-1051.

[6] 杜斯琪，王雪蕊，朱雯，等.針刺對血管性癡呆大鼠前額葉皮層氧化應激及神經元損傷的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2017，24（6）：53-55.

[7] 李慧，王雪蕊，楊靜雯，等.針刺對血管性癡呆大鼠海馬突觸傳遞相關信號分子的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2016，23（7）：77-81.

[8] 秦文熠，羅勇，余超.電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬內白介素-1β及轉錄核因子NF-κB抑制蛋白激酶的影響[J].針刺研究，2013，38（4）：271-276.

[9] 林麗婷，閆超群，曹燕等.針刺對血管性癡呆模型大鼠腦梗死體積與海馬神經元損傷的影響[J].中華中醫藥雜志，2016，31（12）：5182-5185.

[10] 華興邦，李辭蓉，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗，1991（1）：1-5.

[11] PENDLEBURY S T， ROTHWELL P M. Prevalence， incidence， and factors associated with pre-stroke and post-stroke dementia：a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Neurol，2009， 8（11）：1006-1018.

[12] YE Y， ZHU W， WANG X R， et al. Mechanisms of acupuncture on vascular dementia-A review of animal studies[J]. Neurochem Int， 2017，107：204-210.

[13] 隋南，陳雙雙，匡培梓.海馬結構、前額皮層或尾-殼核損毀對大鼠空間認知能力的影響[J].心理學報，1992，24（4）：415-421.

[14] 黃琳娜，安軍明，田文靜，等.方氏頭皮針對血管性癡呆大鼠海馬組織中炎性因子IL-6表達的影響[J].陜西中醫，2013，34（3）：380-381.

[15] OKUN E， GRIFFIOEN K J， LATHIA J D， et al. Toll-like receptors in neurodegeneration[J]. Brain Res Rev，2009，9：278-292.

[16] SONG M， JIN J， LIM J E， et al. TLR4 mutation reduces microglial activation， increases Abeta deposits and exacerbates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer's disease[J]. J Neuroinflammation，2011，8：92.

[17] CHOWELL I L， RUNDLE J L， GARG A， et al. Activated microglia mediate axoglial disruption that contributes to axonal injury in multiple sclerosis[J]. J Neuropathol Exp Neurol，2010，69：1017- 1033.

[18] 李瑩，張興毅.TLR4與腦血管神經疾病的研究進展（綜述）[J].安徽衛生職業技術學院學報，2013，12（6）：80-83.

[19] CAMPBELL I L， ABRAHAM C R， MASLIAH E， et al. Neurologic disease induced in transgenic mice by cerebral overexpression of interleukin 6[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（21）：10061-10065.

[20] 陳秋欣，鄒偉，牛明明，等.針刺對腦出血大鼠血清TNF-α、IL-6含量的影響[J].上海針灸雜志，2015，34（10）：1006-1008.

（收稿日期：2017-11-22）

（修回日期：2017-12-24；編輯：華強）