高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測器測定黃七膠囊中黃芪甲苷的含量

杜鵬 頓寶生 楊新杰 彭修娟

摘要 目的：評價高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法（HPLC-ELSD）黃七膠囊中黃芪甲苷的含量測定。方法：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（32∶68）為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；柱壓11.2～12.3 MPa；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4 000；峰拖尾因子為1.02。結(jié)果：HPLC-ELSD法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率良好。黃芪甲苷對照品進(jìn)樣量在1.0528～10.528 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9，n=7）。結(jié)論：高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定黃七膠囊中黃芪甲苷含量是可行的。

關(guān)鍵詞 黃七膠囊；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法；黃芪甲苷

Abstract Objective：To evaluate contents of astragaloside in Huangqi Capsules measured by HPLC-ELSD. Methods：The octadecyl silane bonding silica gel was the filler， with acetonitrile-water （32∶68） as mobile phase， and the detector was ELSD with the column pressure of 11.2～12.3 MPa and the flow rate of 1.0 mL/min. Column temperature： indoor temperature. Theoretical plate number was calculated by puerarin peak which should not be less than 4 000； Trailing factor was 1.02. Results：The method of HPLC-ELSD had good accuracy， repeatability， stability and recovery rate. A good linearity relationship of the sample size of asreagaloside comparison products in the range of 1.0528-10.528 μg （r=0.999 9， n=7）. Conclusion：Contents of astragaloside in Huangqi Capsules measured by HPLC-ELSD is feasible.

Key Words Huangqi Capsules； HPLC-ELSD； Astragaloside

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.053

中風(fēng)又名“卒中”，其基本病機(jī)為陰陽失調(diào)、氣血逆亂、上犯于腦，導(dǎo)致腦脈痹阻或血溢腦脈之外，臨床以卒然昏仆、不省人事、半身不遂、口舌歪斜、語言不利、偏身麻木為主癥的一種疾病[1]。因本病起病急劇，變化迅速，與自然界善行而數(shù)變之風(fēng)邪特性相似，故古人以此類比，名為中風(fēng)[2]。中風(fēng)是中醫(yī)學(xué)中的4大頑疾之一，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、病死率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人民健康的疾病[3]。中風(fēng)初發(fā)時以風(fēng)證為主；發(fā)病1～2周時，以痰濕證、血瘀證為多；恢復(fù)期以血瘀證、氣虛證為多[4]?，F(xiàn)代血液流變學(xué)研究表明，中風(fēng)患者血液存在著“濃”（紅細(xì)胞比容增高）、“黏”（全血黏度比、血漿黏度比和纖維蛋白原增高）、“聚”（紅細(xì)胞時間性泳時間長）的情況[5]。故益氣活血法為中風(fēng)、特別是中風(fēng)恢復(fù)期的重要治療法則。

黃七膠囊是在黃七湯的基礎(chǔ)上研制而成，由黃芪、土鱉蟲、三七、葛根4味藥材組成，具有益氣活血，化瘀通絡(luò)之功效。用于氣虛血瘀，脈絡(luò)瘀阻所致的中風(fēng)恢復(fù)期，對半身不遂，肢體麻木，口眼歪斜，言語不清或不語，感覺減退或消失治療效果良好[6]。方中君藥黃芪是一味常用中藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效。臨床用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗、氣虛水腫、癰疽難潰、久潰不斂、血虛痿黃、內(nèi)熱消渴，慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等[7]。現(xiàn)代研究表明，黃芪皂苷具有減少腦缺血再灌注（I/R）后神經(jīng)元凋亡[8-10]、降低Ca+超載[11-12]、減少活性氧的損傷[13]、減輕炎性反應(yīng)[14]、促進(jìn)修復(fù)[15]等作用，在中風(fēng)恢復(fù)期的抗細(xì)胞損傷和損傷后修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在新藥研制過程中，我們對黃七膠囊中君藥黃芪的有效成分—黃芪甲苷的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法（HPLC-ELSD）含量測定進(jìn)行方法學(xué)研究，為有效控制黃七膠囊的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 P-3000型高效液相色譜儀；ELSD-UM3000型蒸發(fā)光散射檢測器；Trisep-2003色譜工作站，7725i進(jìn)樣器。

1.2 試藥 10批樣品由楊凌無為制藥集團(tuán)公司自制，黃芪甲苷對照品：中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110781-200613，供含量測定用。3批研究用中試樣品，批號：20100602、20100605、20100608，由該公司膠囊劑車間生產(chǎn)，乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱壓11.2～12.3 MPa；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4 000；峰拖尾因子為1.02。

2.1.2 流動相的選擇比例 將乙腈-水溶液的比例分別選為（28∶72）（32∶68）（36∶64）（40∶60），按正文方法用對照品溶液精密吸取20 μL，作圖，結(jié)果表明，乙腈-水溶液（32∶68）為流動相的分離效果最佳。見表1。

2.2 提取溶劑的選擇

黃芪甲苷在甲醇和水中有較好的溶解度，試用水、25%、50%、75%、100%的甲醇超聲提取，進(jìn)行比較，選擇出最佳的提取溶劑。分別稱取樣品（批號：20100406）5份，（約2.0 g），精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入水，25%、50%、75%、100%的甲醇100 mL，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min），取上清液置蒸發(fā)皿中，殘渣分別用不同濃度的甲醇或水洗滌3次，每次10 mL，洗液并入蒸發(fā)皿中濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇液振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，分別用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。精密吸取對照品溶液10 μL、20 μL與供試品溶液15 μL，注入液相色譜儀測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計算，測定結(jié)果見表2。

上述結(jié)果表明，用50%甲醇提取，黃芪甲苷提取率最高，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.3 超聲時間的確定

分別稱取樣品約2.0 g（批號：20100406）4份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，分別超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）15、30、45、60 min，測定結(jié)果見表3。

上述結(jié)果表明，超聲45 min提取效果最佳，故超聲提取時間確定為45 min。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取濃度為0.5264 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液2、4、8、12、18、20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以Ln峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，Ln含量（X）為橫坐標(biāo)，求得2點(diǎn)對數(shù)方程：Y=1.374 38X+9.90402，r=0.999 9，n=7。見表4。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在1.052 8～10.528 2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品（批號20100406）精密稱定，按正文中供試品制備方法制備樣品，于0、4、8、12、24 h按正文方法測定，即得。結(jié)果表明，本品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見表5。

2.6 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液，在正文色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，結(jié)果見表6。表明本方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號樣品（批號：20100406）6份，按正文中供試品溶液制備方法制備，按正文方法測定含量，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。見表7。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號：20100406，含量為0.6427 mg/粒）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入黃芪甲苷對照品溶液（濃度為0.596 4 mg/mL）2 mL，加入50%甲醇98 mL，以下皆同正文，依正文方法測定，以下式計算回收率：

回收率（%）=測得總量（mg）-已知樣品含量（mg）加入對照品的量（mg）×100%。

結(jié)果表明，本方法回收率良好。見表8。

2.9 樣品測定

按處方量的1/10，分別制備7批樣品，連同成型工藝研究試驗(yàn)的3批樣品，依據(jù)正文中含量測定方法，進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表9，經(jīng)對10批樣品中黃芪甲苷的含量測定，平均值為0.64 mg/粒，考慮到藥材來源及大工業(yè)生產(chǎn)、貯藏等因素，故暫定本品每粒含黃芪甲苷（C41H68O14）不得少于0.52 mg。

2.10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用黑龍江產(chǎn)的蒙古黃芪投藥，制得的3批中試樣品，批號：20100602、20100605、20100608，對該黃七膠囊中黃芪所含黃芪甲苷進(jìn)行了含量測定。另外，在該處方中取掉黃芪，按正文生產(chǎn)工藝投料制作，制成陰性對照品，分別進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表10。

以上3批中試樣品均符合規(guī)定，平均測得值為0.644 mg/粒，含量測定成分黃芪甲苷的轉(zhuǎn)移率為93.33%，證明該標(biāo)準(zhǔn)所指定的黃芪甲苷含量限度可行，陰性對照品在相應(yīng)部位未出峰，證明處方中其他藥材對本含量測定無干擾。見圖1。

3 討論

在提取溶劑的選擇試驗(yàn)中，以外標(biāo)兩點(diǎn)對數(shù)方程計算，用Ln峰面積/Ln稱樣量為篩選指標(biāo)，優(yōu)選出了最佳提取溶劑為50%甲醇，優(yōu)于中華人民共和國藥典2010年版一部黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定用甲醇作為提取溶劑[5]。

中華人民共和國藥典對黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定采用索氏提取器，加熱回流提取4 h，本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取45 min，提取效果最佳，大大節(jié)省了提取時間，降低了能量的消耗。

HPLC-ELSD法簡便、靈敏、準(zhǔn)確。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率及線性關(guān)系良好。黃芪甲苷的含量測定常采用薄層掃描法，但重現(xiàn)性差，且黃芪甲苷只在201 nm處呈現(xiàn)弱的末端吸收，若采用紫外（UV）檢測器測定，干擾非常嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)采用蒸發(fā)光散射（ELSD）檢測器，對黃芪甲苷有通用響應(yīng)，能有效的排除干擾。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、線性關(guān)系良好，平均回收率為98.90%（RSD=0.40%），經(jīng)10批樣品及3批中試樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明該標(biāo)準(zhǔn)所制定的黃芪甲苷含量限度可行，陰性對照品在相應(yīng)部位未出峰，說明處方中其他藥材對本含量測定無干擾。

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