天然藥物化學課程的NMR解析

尹田鵬 蔡樂 陳陽

【摘 要】 以烏頭屬植物玉龍烏龍中分離得到的一個新的苯甲酰胺衍生物stapfianine B的核磁共振波譜（NMR）數據解析為例，講授本科藥學專業天然藥物化學的結構研究章節。Stapfianine B結構中包含苯環、酰胺、酯鍵和酚羥基等常見基團，非常適合作為結構研究的授課內容。

【關鍵詞】 天然藥物化學；核磁共振波譜；stapfianine B；結構解析

【中圖分類號】R-05 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）03-0120-07

Abstract：This paper describes the teaching of pharmaceutical undergraduates curriculum “medicinal chemistry of natural products” according to the nuclear magnetic resonance （NMR） analysis of stapfianine B， a new benzamide derivative isolated from Aconitum stapfianum. Stapfianine B possesses benzene， amide， ester and phenolic hydroxyl groups， and its NMR data are very suitable for NMR teaching.

Keywords：Medicinal Chemistry of Natural Products； NMR； Stapfianine B； Structural Identification and Characterization

1 引言

天然藥物化學是高等醫藥院校藥學及相關專業必修課程，主要講授天然藥物化學成分的理化性質、提取分離及結構鑒定，其中結構鑒定是課程的重要內容。目前，波譜學是天然產物結構鑒定的主要方法，尤其核磁共振波譜法（NMR）提供的結構信息豐富，譜圖可解析性高，已成為天然產物結構鑒定的主要方法。天然產物結構類型繁多，波譜特征復雜，而波譜解析抽象難懂，結構鑒定一直是天然藥物化學的課程難點，是教師不斷探索的教學改革熱點[1-2]。許多醫學院校未設置專門的波譜解析課程，學生沒有系統學習波譜解析，難以理解與掌握天然產物的結構鑒定內容。為讓學生更好地學習這門課程，作者在課程中加強了結構鑒定的講授，尤其是以科研中遇到的真實化合物的NMR綜合解析為例，通過真實譜圖的清晰展示與講解，讓學生更直觀具體地理解與掌握相關知識，提高課程的實踐性[3]。文章介紹以玉龍烏頭（Aconitum stapfianum Hand.-Mazz.）中分離的新苯甲酰胺衍生物stapfianine B為例講解天然藥物化學的結構研究章節[4]。Stapfianine B的結構包含苯環、酰胺、酯鍵和酚羥基等常見基團，波譜信號明顯且不復雜，非常適合作為授課內容。

2 授課內容與方式

2.1 1H-NMR

1H-NMR靈敏度高易測定，已應用于化學中70余年，積累數據豐富，在結構解析中非常重要。首先向學生簡要介紹1H-NMR圖譜，講解氫譜提供的結構信息（圖1）。氫譜橫坐標為峰組位置，用化學位移（δ）表示標注于峰組上方，右邊是高磁場（化學位移小），左邊是低磁場（化學位移大）。縱坐標表示吸收峰強度，可積分得到譜線積分面積（氫的數目）標注于峰組下方。1H-NMR譜中還可見峰組耦合裂分，提供耦合常數（J in Hz）及裂分信息。

2.1.1 峰面積 1H-NMR譜中氫的峰面積與相同化學環境的氫數目成正比。一般用甲基信號為標準計算各組峰質子數，如stapfianine B可用甲氧基信號（δH 3.95 s， 3H）為計算各峰組質子數[5]。

2.1.2 化學位移 化學位移表征官能團出峰位置，其數值大小取決于氫原子核外電子云密度，電子云密度越大化學位移值越小，譜峰越位于氫譜右方，反之亦然。任何使化學位移數值減小的作用稱為屏蔽效應，使化學位移數值增大作用稱為去屏蔽效應。學生應掌握影響化學位移的主要因素：誘導效應、共軛效應、各向異性效應、van der Waals效應和氫鍵效應。

①誘導效應指電負性取代基使氫核外電子云密度降低，去屏蔽效應增大，化學位移增大（吸收峰左移）。如甲基（RCH3）約δH 0.8，由于誘導效應甲氧基低場位移至δH 3.2～4.0，stapfianine B中OCH3-7（δH 3.95 s）。此外應向學生講解電負性取代帶來其他影響，如常見官能團電負性均大于氫的，故一般而言δCH > δCH2>δCH3[6]。

②共軛效應指苯環氫被含飽和雜原子基團取代（如OCH3、OH），雜原子未成鍵電子對和苯環離域電子形成p-π共軛，苯環電子云密度增大，化學位移高場位移；被含不飽和雜原子基團取代（如CHO、COR、NH=NR），形成大的π-π共軛，苯環電子云密度下降，化學位移低場位移。

Stapfianine B氫譜可見一個1，2，4-三取代苯環和一個1，2-二取代苯環信號，七個氫均位于芳環化學位移范圍內（δH 6.5～8.0）。苯的化學位移為δH 7.27，受取代基影響取代苯環的氫產生低場或高場位移。Stapfianine B的B環中羰基-1′與苯環存在π-π共軛，導致苯環電子云密度降低，H-6′受影響最大，H-4′處在羰基對位，受到的去屏蔽作用次之，而H-5′和H-3′反而受到了一定屏蔽作用[7]。基于此，化學位移應該是H-6′ > H-4′ > H-5′/H-3′（圖2A）。另一方面，OH-2′氧孤對電子與苯環形成p-π共軛，導致電子云密度上升，對鄰位氫屏蔽作用最大，對位氫屏蔽其次，間位氫影響最小。因此化學位移應該是H-6′/H-4′ > H-3′ > H-5′（圖2C）。綜合羰基和羥基影響，B環結果是H-6′ > H-4′ > H-5′ > H-3′。A環分析稍復雜些，因還受到NH影響，其屏蔽作用與OH相比稍弱。如圖1所示從羰基-1影響看，化學位移是H-6 > H-4 > H-3；從OH-5影響上看，化學位移為H-3 > H-4 > H-6；NH影響上看，化學位移是H-4 > H-6 > H-3。綜合羰基、羥基和氨基影響，結果為H-3 > H-6 > H-4。以上分析與圖譜吻合，這種講解可加深學生對共軛效應的理解和記憶，教學效果良好。

③各向異性效應指分子中基團電子云非球形對稱時，將對鄰近質子附加一個各向異性磁場，使某些質子處于該基團屏蔽區，產生高場位移，某些質子處于去屏蔽區，產生低場位移。這里主要向學生介紹芳環、雙鍵、羰基、叁鍵的屏蔽區和去屏蔽區位置。

④van der Waals效應指兩個質子空間上靠近時，具有負電荷的電子云相互排斥，電子云密度減少，化學位移向低場位移，可舉典型例子講解。

⑤氫鍵效應指形成分子內氫鍵后，由于靜電場作用電子云密度降低而去屏蔽，化學位移增大。天然產物中δH 10～18羥基峰即為氫鍵效應導致。如stapfianine B中OH-2′（δH 12.34 s）與酰胺鍵羰基形成氫鍵[8-9]。類似，NH也與甲酰基羰基形成氫鍵而產生低場效應（δH 11.94 s）。

2.1.3 偶合裂分及耦合常數 耦合裂分是分子中鄰近磁性核之間自旋-自旋耦合作用引起，作用大小以偶合常數表示。解析氫譜耦合裂分現象對于確定分子中各類氫的相對位置和立體關系很有幫助。可依據n+1規律判斷：當某組質子有n個相鄰的質子時，這組質子將裂分為n+1重峰。耦合常數是氫譜重要數據，影響偶合常數因素主要有偶合核間的距離、角度及電子云密度[10]。Stapfianine B中氧甲基、酚羥基及酰胺氨基鄰位沒有氫取代，故為單峰（s）。A環中H-3與H-4發生J3偶合，故峰形為標準二重峰（d），苯環J3偶合常數一般約8.0 Hz（實際8.8 Hz）。H-6與H-4發生J4偶合，峰形也為d峰，J4偶合常數比較小，一般0～3 Hz（實際2.4 Hz）。H-4則除了與H-3發生J3偶合，還與H-6發生J4偶合，故峰形為雙二重峰（dd），偶合常數為8.8 Hz和2.4 Hz。B環是不同基團的鄰位取代苯環，譜圖非常復雜。但因核磁儀器頻率不高，苯環氫化學位移差異小，可作一級譜近似分析。H-3′和H-6′鄰位只有1個氫，故裂分為d峰，H-4′和H-5′鄰位2個氫，故裂分為三重峰（t）。

2.2 13C-NMR和DEPT 13C-NMR靈敏度低于氫譜但分辨率更高（常用δH 0～15，δC 0～300），且碳原子是構成有機物骨架的元素，13C-NMR可提供分子骨架信息，故在有機物結構鑒定中作用極大。這里主要向學生介紹常用13C-NMR測定技術質子寬帶去耦法和DEPT法進行結構解析（圖3）。與氫譜類似碳譜橫坐標是化學位移（δ），縱坐標為吸收峰強度。采用去耦技術的碳譜只有譜線而不進行積分。13C-NMR譜中每一個碳都出現一個信號，而DEPT 135°譜季碳消失，亞甲基向下，次甲基和甲基向上，DEPT 90°譜只有向上的次甲基。據此可判斷每個碳的級數，區分結構中的季碳、次甲基、亞甲基和甲基。

Stapfianine B中15個碳均在13C NMR譜出現信號。13C-NMR譜中酯基和酰胺基的羰基化學位移在最低場，分別在δC 168.9 s和δC 168.8 s。氧甲基（δC 52.9 q）碳受到誘導效應而產生明顯低場位移，一般RCH3約δC 15～30，OCH3則δC 45～60。苯的碳化學位移為δC 128，與氫類似受取代基影響化學位移在δC 120～160波動。同樣對于選定的碳原子，其變化量是幾個取代基效應之和。B環中C-2′因為電負性取代基的誘導效應影響（OH-2），出現在δC 162.2。羥基取代使苯環其它碳原子高場位移，影響大小鄰位（C-1′/C-3′）>對位（C-5′）>間位（C-6′/C-4′），故化學位移為C-2 > C-4/C-6 > C-5 > C-1/C-3。羰基取代對苯環取代碳和其它碳影響都較小，僅使苯環碳略往低場移動。結合羥基和羰基影響，B環化學位移為C-2 > C-4 > C-6 > C-5 > C-3 > C-1。A環和B環類似，但增加了氨基影響，其效應與-OH一致。

2.3 二維核磁共振譜 2D NMR是有機物結構鑒定的有力工具，尤其是對未知物的結構的推導，比1D NMR能夠提供更多的信息，更為客觀、可靠。常用的2D NMR技術主要有1H-1H COSY、HMQC、HMBC和ROESY等，結合stapfianine B的圖譜向學生依次進行介紹。

2.3.1 1H-1H COSY譜 1H-1H COSY是最常用的2D NMR譜，反映的同一個耦合體系中質子的相關（3J），即相鄰兩個碳上的氫或同一個碳化學不等價的兩個氫的相關。在譜圖中可以看到stapfianine B的A環H-3/H-4的相關，B環H-3/H-4，H-4/H-5，H-5/H-6的相關（圖4）。這些相關驗證了1D NMR對Stapfianine B結構的推斷。

2.3.2 HSQC譜 HSQC譜反映的是1H和與其直接相連13C的相關。通過HSQC可建立碳譜和氫譜的關聯，實現氫原子往碳原子上的歸屬，對于推導未知物的結構或已知結構化合物的碳譜和氫譜的指認十分重要。在譜圖中可以看到A環H-3/C-3，H-4/C-4、H-6/C-6的相關（圖5）；B環H-3/C-3，H-4/C-4，H-5/C-5，H-6/C-6的相關，通過這些相關可對stapfianine B的碳氫譜數據進行歸屬。氫譜中剩余無相關的峰組，則認為是活潑氫（OH，NH）。

2.3.3 HMBC譜 HMBC譜反映的是1H和遠程耦合的13C的相關，即關聯跨越2～4根化學鍵的1H和13C。HMBC譜比較復雜，解析困難，但對于推斷結構極為重要。因為1H-1H COSY譜和HMQC譜在未知物的結構推斷中，往往終止于季碳和雜原子，只能得到結構片段，這些片段的連接只能依靠HMBC譜來完成。Stapfianine B的關鍵HMBC相關如圖6所示，H-3/C-2，屬于相隔2根化學鍵的相關，H-3/C-1，H-3/C-5是相隔3根化學鍵的相關，在HMBC譜中作用最大。H-6′與酰胺鍵羰基的相關正是Stapfianine B中兩個片段通過酰胺鍵連接的關鍵證據。H-6與甲酰基羰基相關是甲酰基-1取代位置的關鍵證據。從這個圖譜可以讓學生清楚了解HMBC譜圖在結構解析中的強大功能。

2.3.4 ROESY譜 ROESY譜反映的是兩個氫的空間距離，主要用于解決立體化學的問題。譜中H-3/H-4，H-3′/H-4′，H-4′/H-5′，H-5′/H-6′的相關屬于鄰位氫相關，在結構鑒定中意義不大（圖7）。H-6′/氨基的相關對于驗證和確定B苯環的取代基位置有一定參考意義。

3 教學效果

天然藥物化學的結構解析內容抽象難懂，學生難以理解和掌握。教材著重于基礎理論而應用性不強，學生往往掌握了課本知識遇到具體天然產物的NMR解析仍無從下手。通過科研中的原始天然產物真實譜圖的清晰展示和詳細講解，系統地向學生介紹核磁共振主要譜圖的功能。學生可以直觀、具體地接觸到核磁譜圖，從而更好地理解與掌握NMR的相關知識及其應用。講解過程，學生可充分參與進來，通過辨識譜峰（包括溶劑峰、雜質峰），獲得化學位移和積分數據，計算偶合常數，尋找二維相關等，使知識不再停留在理論，學生可獲得綜合運用波譜進行化合物結構解析的能力，掌握天然化合物結構解析的方法和步驟。這種教學方式有助于學生接受與理解教學內容，讓學生深刻理解該課程的意義，并通過對課程的學習養成良好的科研素養，也提高了課程的實踐性，提高學生學習新知識的主動性和積極性，為培養創新型、實踐型高素質人才打下堅實基礎。

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（收稿日期：2017-12-12 編輯：鄧佳麗）