藏藥沙棘總黃酮防治慢性支氣管炎的網絡藥理學研究

任青措 余羊羊 切尼項毛 扎西卓瑪 降擁四郎 張藝 澤翁擁忠

摘 要 目的：探討藏藥沙棘總黃酮（TFH）防治慢性支氣管炎的潛在作用機制，為其進一步開發(fā)利用提供參考。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數據庫篩選TFH有效成分，通過PharmMapper網絡服務系統(tǒng)、BATMAN-TCM網絡藥理學研究平臺、DrugBank數據庫、OMIM數據庫預測并匹配TFH有效成分作用于慢性支氣管炎的潛在靶點（即靶基因），借助生物分子功能注釋系統(tǒng)3.0進行GO富集和KEGG通路注釋分析，采用Cytoscape 3.5.1軟件構建TFH防治慢性支氣管炎的“成分-靶點-通路”網絡，并進行網絡拓撲學分析。結果：共篩選出槲皮素、表兒茶素、槲皮素-3-甲基醚等13個TFH有效成分，涉及PIK3CG、PRKCA、ALOX5基因等30個潛在作用靶點。上述靶點多分布于細胞膜和細胞質中，且主要通過蛋白質氨基酸磷酸化反應、信號轉導等生物過程以及蛋白結合、轉移酶活性調節(jié)等分子功能來發(fā)揮對慢性支氣管炎的防治作用。上述靶點共涉及64條通路，靶點富集數量排名前10位的通路分別為Fc epsilon RI信號通路、血管內皮生長因子信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路、T細胞受體信號通路、膠質瘤、ErbB信號通路、Toll樣受體信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、非小細胞肺癌、黏著斑。TFH防治慢性支氣管炎的“成分-靶點-通路”網絡共有107個節(jié)點、449條邊，平均節(jié)點度值為8.299，網絡中心度為0.411。其中，Fc epsilon RI信號通路、血管內皮生長因子信號通路和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路是該網絡的核心通路（節(jié)點度值≥9，中介中心性>0.001），MAPK1、PIK3CG、AKT1等基因是該網絡的核心靶點（節(jié)點度值≥40，中介中心性>0.1）。結論：TFH有效成分槲皮素、表兒茶素、槲皮素-3-甲基醚等可能通過Fc epsilon RI信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路、血管內皮生長因子信號通路等作用于MAPK1、PIK3CG、AKT1等靶點，進而發(fā)揮對慢性支氣管炎的防治作用。

關鍵詞 網絡藥理學；藏藥；沙棘；沙棘總黃酮；慢性支氣管炎；作用機制

中圖分類號 R29；R285；R562.2+1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3119-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.21

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the potential prevention and treatment mechanism of total flavonoids of Tibetan medicine Hippophae rhamnoidesh （TFH） on chronic bronchitis， and to provide reference for further development and utilization. METHODS： TCM system pharmacology analysis platform database （TCMSP） was used to screen effective components of TFH. PharmMapper network service system， BATMAN-TCM network pharmacology research platform， DrugBank database and OMIM database were all used to predict and match effective components of TFH on the potential target （target gene） of chronic bronchitis. GO enrichment and KEGG pathway annotation analysis were conducted by biomolecular function annotation system 3.0. Cytoscape 3.5.1 software was used to establish TFH “component-target-pathway” network for the prevention and treatment of chronic bronchitis. The network topology was also analyzed. RESULTS： The network analysis indicated that there were 13 active components in TFH， such as quercetin， ent-epicatechin and quercetin-3-methylethter， which could interact with 30 potential targets， such as PIK3CG， PRKCA， ALOX5， etc. Above targets were mainly distributed in cell membrane and cytoplasm. TFH played prevention and treatment effect through biological processes as protein amino acid phosphorylation reaction， signal transduction， and molecular functions such as protein binding， transferase activity regulation. Above targets involved 64 pathways in total. Top 10 pathways in the list of target enrichment number were Fc epsilon RI signaling pathway， VEGF signaling pathway， MAPK signaling pathway， T cell receptor signaling pathway， glioma， ErbB signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway， natural killer cell mediated pathway， non-small cell lung cancer and focal adhesion. There were 107 nodes， 449 edges， 8.299 flatness and 0.411 network centricity in the “component-target-pathway” network for the prevention and treatment of chronic bronchitis. Fc epsilon RI signaling pathway， VEGF signaling pathway and MAPK signaling pathway were the core pathways of this network （node degree≥9， intermediary centrality>0.001）. MAPK1， PIK3CG and AKT1 were the core targets of the network （node degree≥40， intermediary centrality>0.1）. CONCLUSIONS： The effective components of TFH as quercetin， ent-epicatechin， quercetin-3-methylethter act on the targets of MAPK1， PIK3CG and AKT1 through Fc epsilon RI signaling pathway， VEGF signaling pathway and MAPK signaling pathway， and then play a role in the prevention and treatment of chronic bronchitis.

KEYWORDS Network pharmacology； Tibetan medicine； Hippophae rhamnoides； Total flavonoids of Hippophae rhamnoidesh； Chronic bronchitis； Mechanism

沙棘為胡頹子科沙棘屬植物沙棘（Hippophae rhamnoides L.）的干燥成熟果實，是藏族、蒙古族習用藥材[1]，具有悠久的藥用歷史。該藥首載于《月王藥診》[2]，在藏醫(yī)巨著四部醫(yī)典之《藏醫(yī)藥理學》[3]中提到并肯定其為治療呼吸道疾病的要藥。藏藥典籍《晶珠本草》[4]中記載：“沙棘利肺止咳，活血化瘀，利心臟血脈，消痰濁”。《藏醫(yī)內科學》[5]中明確記載：“五味沙棘散可清肺利痰”。據2015年版《中國藥典》（一部）[1]記載，沙棘有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀之功效。

慢性支氣管炎是指氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，其主要臨床表現為咳嗽、咯痰并伴有喘息[6]。該病為我國常見病、多發(fā)病、難治病之一，尤其以老年人多見，其發(fā)病人數占老年人總數的10%～15%，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[7]。該病的發(fā)病機制尚未完全闡明，通常認為與大氣污染、氣候等環(huán)境因素以及吸煙、感染、免疫力低下等個體因素有關[8]。根據該病的臨床表現，藏醫(yī)將其歸于“肺部鐵布癥”“肺隆癥”等范疇，并對其病因、病機、辨證及治療進行了深入的研究，積累了豐富的臨床經驗。藏醫(yī)理論認為該病是由“隆”“赤巴”“培根”三大基因平衡失調，培根偏盛，導致培根黏液激增堵塞氣道，對局部氣管、支氣管及黏膜造成損傷，從而引發(fā)；這與現代藥理研究認為的氣道黏液高分泌為該病病理機制的學說極為相似[9]?，F代研究表明，沙棘的主要活性成分為黃酮類化合物（即2個苯環(huán)通過中央三碳相互連接而成），具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛以及提高機體免疫力、鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙、抗變態(tài)反應等藥理活性[10]。盡管目前關于沙棘總黃酮（TFH）藥理作用的研究較多，但針對其防治慢性支氣管炎的作用機制及其靶點仍不清楚。網絡藥理學的概念由英國學者Hopkins AL等于2007年提出，是通過構建藥物-靶點-疾病之間的復雜網絡來探討藥物潛在作用機制的一門學科[11]，與藏醫(yī)藥對疾病診斷的綜合觀、整體觀以及對治療的辨證觀等理念相吻合。鑒于此，本研究擬借助網絡藥理學的思路，從系統(tǒng)生物整體的角度探究TFH防治慢性支氣管炎的可能機制，以期為其后續(xù)實驗研究及進一步開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 TFH有效成分的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數據庫（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）查詢沙棘所含的化學成分，并根據TCMSP的推薦，通過口服利用度（OB）和類藥性（DL）對其進行篩選（其中，OB是客觀評價藥物分子口服生物利用度的重要指標，DL則是可用以評價藥物分子成藥性優(yōu)劣的指標）[12-13]。本研究在已有文獻的基礎上，以OB≥30%、DL≥0.8作為篩選條件[14]，對TFH的化學成分進行篩選，并通過有機小分子生物活性數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進行結構辨別，確認TFH的有效成分。

1.2 TFH有效成分潛在靶點的預測及篩選

將“1.1”項下篩選所得的TFH有效成分以MOL2格式導入PharmMapper網絡服務系統(tǒng)（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper）和BATMAN-TCM網絡藥理學研究平臺（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），對TFH有效成分進行靶點預測。下載預測結果，去重后，運用UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org/uniprot/）檢索功能（通過蛋白編碼檢索，并限定物種為“人”），最終獲取與TFH有效成分相關的靶點（即靶基因）信息。

1.3 疾病靶點篩選

鑒于“慢性支氣管炎”相關信息較少，故將與其相關的疾病及機制如“氣道炎癥”“氣道重塑”等關鍵詞輸入DrugBank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）和OMIM數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim），組合檢索與慢性支氣管炎防治相關的靶點，去重后，與“1.2”項下TFH有效成分的相關靶點進行匹配，得到TFH有效成分可用于防治慢性支氣管炎的潛在靶點。

1.4 靶點通路富集分析

將“1.3”項下所得的潛在靶點信息導入生物分子功能注釋系統(tǒng)3.0（MAS 3.0，http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/），獲取相關通路信息，通過GO富集分析探討TFH有效成分防治慢性支氣管炎潛在作用靶點的功能分布（細胞部位、生物過程、分子功能），通過KEGG通路注釋探討TFH防治慢性支氣管炎作用潛在靶點的通路分布，選取靶點數目排名前10位且具統(tǒng)計學意義（P<0.01）的通路進行分析。MAS 3.0參數設置如下——Species：Homo sapiens（Human）；Molecule type：protein；Database symbols：Gen Bank ACC；Functions：gene，mRNA，protein，pathway；Regulation threshold：2.0（up），0.5（down）。

1.5 TFH“成分-靶點-通路”網絡構建及核心靶點篩選

采用Excel 2016軟件創(chuàng)建“成分-靶點”、“靶點-通路”電子表格，將其導入Cytoscape 3.5.1軟件（http：//cytoscape.org/）中，進行“成分-靶點-通路”網絡構建，以節(jié)點（Node）表示活性成分、靶點和通路，節(jié)點之間以邊（Edge）相連接；運用該軟件的“Network analyzer”插件計算出重要的網絡拓撲學參數，以對該網絡的核心靶點進行分析。其中，節(jié)點度值（Degree）為網絡中與某節(jié)點相連邊的數量，其值越大，表示該節(jié)點在網絡中越重要；中介中心性（Betweeness centrality）以網絡中經過某節(jié)點最短路徑的數量來反映該節(jié)點對網絡中其他節(jié)點的影響力，其值越大，則表明該節(jié)點在網絡中的影響力越大、重要程度越高；網絡中心度（Network centralization）表示網絡是否具有較高的中心趨勢，其值越大，表示不同節(jié)點之間的關聯(lián)越緊密。

2 結果

2.1 TFH有效成分篩選結果

經TCMSP數據庫共檢索得沙棘化合物223個，根據OB、DL值共篩選出TFH有效成分13個，包括槲皮素、表兒茶素、山柰素等。經PharmMapper網絡服務系統(tǒng)和BATMAN-TCM網絡藥理學研究平臺共檢索到與上述有效成分相關的靶點148個，與DrugBank和OMIM數據庫檢索結果匹配后，共得與慢性支氣管炎防治有關的TFH有效成分潛在作用靶點30個，包括PIK3CG、PRKCA、ALOX5等基因，詳見表1。

由表1可見，槲皮素的靶點最多（13個），其次依次為表兒茶素（9個）、槲皮素-3-甲基醚（8個）、山柰素（7個），提示TFH不同有效成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，充分體現了其多成分、多靶點防治慢性支氣管炎的作用特點。

2.2 GO富集分析及KEGG通路注釋

GO富集分析結果顯示，TFH有效成分的潛在作用靶點多分布于細胞膜和細胞質中，且主要通過蛋白質氨基酸磷酸化反應、信號轉導等生物過程以及蛋白結合、轉移酶活性調節(jié)等分子功能來發(fā)揮對慢性支氣管炎的防治作用，詳見圖1。

KEGG通路注釋分析結果顯示，TFH有效成分的30個潛在作用靶點共涉及64條通路，靶點數量排名前10位的信號通路包括Fc epsilon RI信號通路、血管內皮生長因子信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路、T細胞受體信號通路、黏著斑、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、ErbB信號通路、非小細胞肺癌、膠質瘤、Toll樣受體信號通路等，詳見表2。

2.3 TFH“成分-靶點-通路”網絡分析及核心靶點

用Cytoscape 3.5.1軟件構建TFH“成分-靶點-通路”網絡，詳見圖2（圖中，最內圈長方形表示TFH防治慢性支氣管炎的有效成分，中間圈圓形表示其潛在作用靶點，最外圈箭頭表示靶點富集通路）。由圖2可見，本網絡共有107個節(jié)點、449條邊，平均節(jié)點度值為8.299，網絡中心度為0.411，TFH的13個有效成分通過直接或間接作用于30個靶點，再富集到64條通路上。

其中，節(jié)點度值、中介中心性排名前10位的信號通路及其網絡拓撲學參數見表3，節(jié)點度值、中介中心性排名前16位的靶點及其網絡拓撲學參數見表4。

由表3可見，Fc epsilon RI 信號通路、血管內皮生長因子信號通路和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路是TFH有效成分防治慢性支氣管炎的核心作用通路，其節(jié)點度值≥9，中介中心性>0.001。由表4可見，MAPK1、PIK3CG、AKT1等基因是網絡中的核心靶點，其節(jié)點度值≥40，中介中心性>0.1。

3 討論

網絡藥理學是通過網絡數據庫進行網絡構建及分析來預測不同節(jié)點關聯(lián)性的一門學科。其打破了“一個藥物、一個靶點、一種疾病”的傳統(tǒng)理念，為中藥與民族藥多成分、多靶點、多途徑效應研究提供了可量化的數據，有助于實現對單味藥多成分或復方藥作用機制的整體化、系統(tǒng)化探索[12]。本研究借助網絡藥理學手段對TFH有效成分防治慢性支氣管炎的潛在作用機制進行了探討。

有效成分篩選結果顯示，TFH中有13個防治慢性支氣管炎的潛在有效成分，包括槲皮素及其甲基醚、表兒茶素、山柰素，異鼠李素等。其中，槲皮素及其甲基醚、表兒茶素具有抗炎、抗氧化、清除自由基的作用[13-14]；山柰素可通過抑制支氣管上皮細胞內質網應激反應所致的氣道黏液增多，從而緩解慢性氣道疾病患者的癥狀[15]；異鼠李素對脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷動物模型具有一定保護作用[16]。

采用網絡藥理學進一步對上述有效成分的核心作用靶點進行分析。結果顯示，其潛在作用靶點包括MAPK1、PIK3CG、AKT1、EGFR等基因。其中，MAPK1編碼蛋白是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，也稱為細胞外信號調節(jié)激酶（Erk2），主要集中在支氣管平滑肌細胞的胞漿中，既往研究發(fā)現，抑制該蛋白的表達可有助于減少細胞外基質沉積、抑制細胞增殖及遷移、降低炎癥因子表達，從而緩解氣道重塑，減輕氣道炎癥損傷[17-18]。PIK3CG編碼蛋白屬于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的一個亞型，其在維持上皮細胞的結構和功能完整性中起著重要作用[19]。有研究表明，PI3K酶可通過激活下游信號分子蛋白激酶B（Akt）及p70S6K的釋放，從而促進哮喘模型大鼠氣道平滑肌細胞的增殖；經PI3K特異性抑制劑Wortmannin干預后，該途徑被阻斷，氣道平滑肌細胞的增殖受到抑制。由此可見，阻斷該途徑可能成為慢性支氣管炎的防治手段之一[20]。EGFR編碼蛋白是表皮生長因子受體（EGFR）家族成員之一，活化后的EGFR參與了氣道上皮細胞向杯狀細胞的轉化過程，同時還可促進氣道黏蛋白的合成，進一步增加氣道黏液的分泌，加重氣道堵塞[21]。Lee HM等[22]將瓊脂糖凝膠滴入大鼠氣管，造成其氣道堵塞，發(fā)現氣道堵塞可啟動大鼠體內EGFR及其編碼蛋白的激活和表達增高，致使黏膜上皮細胞分化形成分泌黏液的杯狀細胞。由此可見，阻斷或抑制EGFR的表達可有助于緩解慢性支氣管炎。

GO富集分析結果顯示，TFH有效成分的潛在作用靶點多分布于細胞膜和細胞質中，且主要通過蛋白質氨基酸磷酸化反應、信號轉導等生物過程以及蛋白結合、轉移酶活性調節(jié)等分子功能來發(fā)揮對慢性支氣管炎的防治作用。KEGG通路注釋分析結果顯示，與TFH有效成分防治慢性支氣管炎的潛在作用靶點相關的信號通路共有64條，在富集靶點數量排名前10位的通路中，Fc epsilon RI信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路、黏著斑、T細胞受體信號通路和Toll樣受體信號通路與機體炎癥反應和免疫應答有關；血管內皮生長因子信號通路、ErbB信號通路和自然殺傷細胞介導的細胞毒性與細胞的增殖與凋亡有關；膠質瘤、非小細胞肺癌與內分泌調節(jié)有關[23-24]。既往有研究表明，在慢性支氣管炎發(fā)生、發(fā)展的過程中，Fc epsilon RI信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路、T細胞受體信號通路等均被激活，其中Fc epsilon RI受體與過敏原結合的免疫球蛋白E（IgE）交聯(lián)，誘導炎癥介質的釋放，并在30 min內快速啟動炎癥反應[25]；通過下調Fc epsilon RI受體的表達，可有效緩解慢性支氣管炎患者的炎癥應激反應[26]。絲裂原激活的蛋白激酶信號轉導途徑在整個慢性支氣管炎的發(fā)病機制中起到了非常重要的作用。孟曉明[27]研究表明，絲裂原激活的蛋白激酶信號轉導通路與p38和JNK蛋白的磷酸化水平有關，通過抑制該通路的活性，可降低上述兩種蛋白的磷酸化水平，從而緩解LPS誘導的慢性支氣管炎模型大鼠的氣道炎癥。血管內皮生長因子是近年來發(fā)現的一種具有高度特異性的細胞因子，其表達水平的升高可導致血管內皮細胞通透性增加和炎癥細胞浸潤[28]，而長期的氣道慢性炎癥可促進血管內皮生長因子合成和分泌。Hoshino M等[29]研究發(fā)現，慢性支氣管炎合并哮喘患者體內血管內皮生長因子水平明顯升高，可進一步引起血漿蛋白外滲，從而加重氣道重塑及慢性炎癥性氣道疾病。本研究網絡分析和核心靶點分析結果顯示，TFH有效成分對慢性支氣管炎的防治作用主要與調節(jié)氣道炎癥反應（MAPK1）、抑制氣道黏液分泌（EGFR）、調控細胞增殖及凋亡（PIK3CG、AKT1）等靶點密切相關，涉及Fc epsilon RI 信號通路、血管內皮生長因子信號通路和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路等多個通路。

綜上所述，本研究借助網絡藥理學的研究方法，對TFH防治慢性支氣管炎的多成分、多靶點、多途徑的潛在作用機制進行了分析。結果表明，TFH有效成分槲皮素、表兒茶素、槲皮素-3-甲基醚等可能通過Fc epsilon RI信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路、血管內皮生長因子信號通路等作用于MAPK1、PIK3CG、AKT1等靶點，進而發(fā)揮對慢性支氣管炎的防治作用，為沙棘及TFH的進一步開發(fā)利用提供了參考。但由于網絡藥理學主要依賴現有文獻和生物數據庫，故可用數據源具有一定的局限性；加之該學科著重于定性分析，在藥物有效成分及作用靶點的分布差異等生物網絡分析和定量檢測方面還有所欠缺[30-31]，故本研究結論可能存在一定的片面性，仍有待后續(xù)研究進一步證實。

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（收稿日期：2018-05-10 修回日期：2018-10-18）

（編輯：張元媛）