組織工程化干細(xì)胞聯(lián)合PRP在骨不連中的臨床應(yīng)用

趙寶平 葉川 江深河 武成興 謝大偉 李江龍 劉志偉 許明友 付紅軍

摘 要：目的 比較骨不連患者采用組織工程干細(xì)胞聯(lián)合PRP和常規(guī)開放固定+有效植骨治療的臨床療效。方法 將骨不連患者43例分為治療組22例和對(duì)照組21例，治療組患者采用組織工程化干細(xì)胞聯(lián)合PRP移植治療，對(duì)照組采用開放內(nèi)固定+有效植骨治療。比較患者兩組手術(shù)時(shí)間、出血量、住院費(fèi)用、住院時(shí)間、切口愈合等級(jí)、有無取自體骨等相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果 隨訪9～15個(gè)月后，治療組骨折愈合率為86.36%，對(duì)照組骨折愈合率為85.70%，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在手術(shù)時(shí)間、出血量、住院費(fèi)用、住院時(shí)間方面，對(duì)照組均高于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；切口愈合方面，對(duì)照組有2例患者出現(xiàn)Ⅱ級(jí)愈合，治療組患者均為Ⅰ級(jí)愈合；有無取自體骨：治療組無一例取自體骨，對(duì)照組均取自體骨。結(jié)論 組織工程化干細(xì)胞聯(lián)合PRP可作為一種有效的治療骨不連的方法，較常規(guī)手術(shù)方法更微創(chuàng)，操作更簡便，損傷小，節(jié)約經(jīng)濟(jì)，減少住院時(shí)間，未來可作為治療骨不連的一種有效的方法。

關(guān)鍵詞：組織工程；間充質(zhì)干細(xì)胞；富含血小板血漿；骨不連

中圖分類號(hào)：R687.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.12.020

文章編號(hào)：1006-1959（2018）12-0065-04

Abstract：Objective To compare the clinical efficacy of tissue-engineered stem cells combined with PRP and conventional open fixation+effective bone grafting in patients with non-union.Methods 43 patients with nonunion were divided into treatment group（22 cases）and control group（21 cases）.The treatment group patients were treated with tissue-engineered stem cells combined with PRP transplantation，and the control group was treated with open internal fixation+effective bone grafting.The two groups of patients were compared for operative time，blood loss，hospitalization costs，length of stay，incision healing grade，and whether autologous bone was taken or not.Results After 9 to 15 months of follow-up，the fracture healing rate was 86.36% in the treatment group and 85.70% in the control group.There was no significant difference between the two groups（P>0.05）；The operative time，blood loss，hospitalization costs，and length of hospital stay were higher in the control group than in the treatment group，the difference was statistically significant （P<0.05）.In wound healing，two patients in the control group had grade II healing，and all patients in the treatment group had grade I healing；Whether or not autologous bone was taken：No autologous bone was used in the treatment group，and autologous bone was used in the control group.Conclusion Tissue-engineered stem cells combined with PRP can be used as an effective method for the treatment of bone non-union，which is more minimally invasive，easier to operate，less damaged，economical，and less time spent in hospital.The future can be used as an effective treatment for non-union.

Key words：Tissue-engineered；Mesenchymal stem cells；Platelet-rich plasma；Non-union

骨不連一直以來是困擾骨科醫(yī)師的難題[1]，臨床上常見的方法是開放手術(shù)，取自體骨或同時(shí)更換內(nèi)固定方式[2]，因其手術(shù)創(chuàng)傷較大，出血較多，費(fèi)用高，取自體骨骨副損傷等，一直不被患者所接受。近年來隨著干細(xì)胞、生物材料學(xué)及組織工程技術(shù)的發(fā)展，使干細(xì)胞和PRP（platelet-rich plasma）移植治療骨不連的研究逐漸成為骨科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[3]。既往都采用單一方法治療骨不連，效果較好但仍存在失敗病例，間充質(zhì)干細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞分化的能力、PRP中的TGF因子家族有促進(jìn)干細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化和局部血管化的生物學(xué)效應(yīng)，如能聯(lián)合二者對(duì)骨不連進(jìn)行治療，理論上有增加療效的功能，且在本研究中我們使血漿成分凝膠化，使血漿轉(zhuǎn)換為可吸收生物材料而負(fù)載干細(xì)胞和PRP中的生長因子成分，形成組織工程化干細(xì)胞-PRP凝膠，避免了局部注入的干細(xì)胞和PRP流失的弊端，固化和增加了二者在局部發(fā)揮更大的生物學(xué)效應(yīng)，文章總結(jié)興義市人民醫(yī)院骨創(chuàng)傷科近4年來組織工程化干細(xì)胞聯(lián)合PRP治療骨不連的手術(shù)，比較了兩種手術(shù)的臨床療效及相關(guān)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集興義市人民醫(yī)院于2013年3月～2017年6月因骨不連行手術(shù)治療的患者43例，本實(shí)驗(yàn)采用非隨機(jī)同期對(duì)比觀察，已獲得興義市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。根據(jù)手術(shù)方法將所有患者分為治療組和對(duì)照組。治療組22例，男17例，女5例，年齡19～65歲，平均年齡（42.50±1.11）歲；BMI 20.20～25.11 kg/m2，平均BMI（24.30±1.01）kg/m2。對(duì)照組21例，男16例，女5例，年齡20～57歲，平均年齡（40.50±1.11）歲；BMI 21.61～26.30 kg/m2，平均BMI（23.66±1.01）kg/m2。兩組患者性別、年齡、BMI等一般資料相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2診斷、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照文獻(xiàn)[4]，根據(jù)患者的臨床及影像學(xué)指標(biāo)診斷骨不連。

1.2.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；②排除感染性骨不連；③患者同意行該手術(shù)方案。

1.2.3排除標(biāo)準(zhǔn) ①感染性骨不連；②下肢血管性疾病；③局部皮膚條件不允許[5]。

1.3方法

1.3.1材料 ①治療組：離心機(jī)（實(shí)驗(yàn)室醫(yī)用離心機(jī)80-1），離心管（50 ml），凝血酶（500 U/支），穿刺針。②對(duì)照組：鎖定鈦板（北京富樂科技開發(fā)有限公司），髓內(nèi)釘（蘇州康力骨科器械有限公司），輔助工具為不銹鋼。

1.3.2術(shù)前準(zhǔn)備 所有患者入院后行全面的體格檢查和輔助檢查，評(píng)估手術(shù)耐受情況，血壓控制在150/90 mmHg以下，血糖8.0 mmol以下，CRP 10 mg/L以下，ESR 20 mm/h以下。

1.3.3手術(shù)方法 治療組行組織工程化干細(xì)胞聯(lián)合PRP治療，原內(nèi)固定不更換。間充質(zhì)干細(xì)胞采集方法：重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，予患者400 μg/d皮下注射，1次/d，連用4 d。檢查外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，使外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)控制在（3～4）×1010/L。監(jiān)測(cè)白細(xì)胞變化，當(dāng)白細(xì)胞升至平均20～250倍時(shí)，應(yīng)用血細(xì)胞分離機(jī)循環(huán)全省血液分離出濃度為（1～3）×1011/L的外周血干細(xì)胞懸液，離心待用。PRP采用二次離心分離技術(shù)，取中層血小板富集區(qū)待用[6]。同法取髂前上棘為穿刺點(diǎn)，抽取取骨髓血50 ml，應(yīng)用血細(xì)胞分離機(jī)分離出濃度為（1～3）×1011/L的骨髓干細(xì)胞懸液，離心待用。 干細(xì)胞懸液和PRP混合后共10 ml，混勻后加入凝血酶適量，按照（1 ml∶100 U），制成凝膠待用。根據(jù)患者骨不連的特征，對(duì)于肥大型的采用X線下定位穿刺骨折斷端，細(xì)小刮匙刮除創(chuàng)面硬化骨，多點(diǎn)注入骨折斷端，有效的外固定。對(duì)萎縮性骨不連及滑膜性假關(guān)節(jié)采用小切口切開骨折斷端纖維清理，骨折復(fù)位后將制備好的凝膠樣物放入骨折斷端，關(guān)閉傷口，對(duì)骨折做有效的固定。

對(duì)照組行開放手術(shù)更換內(nèi)固定+自體骨植骨治療。取同側(cè)髂骨松質(zhì)骨適量備用，沿原切口進(jìn)入，顯露清理骨折斷端，更換內(nèi)固定，將備用的松質(zhì)骨打壓植入骨折端，放置引流，關(guān)閉切口。手術(shù)后根據(jù)固定可靠程度及部位在患者可耐受情況下決定開始功能鍛煉時(shí)間。

1.3.4術(shù)后處理 術(shù)后預(yù)防性抗生素治療3 d，對(duì)照組中引流管24 h后拔除，出院1、3、6、12、15個(gè)月復(fù)查，根據(jù)復(fù)查結(jié)果指導(dǎo)功能鍛煉、負(fù)重和拆除內(nèi)固定時(shí)間。

1.4觀察指標(biāo) 參照文獻(xiàn)[6]，根據(jù)患者的癥狀體征及影像學(xué)指標(biāo)診斷骨愈合，根據(jù)骨折愈合標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)骨折愈合率，手術(shù)時(shí)間（h），出血量（ml），住院費(fèi)用（元），住院時(shí)間（d），切口愈合等級(jí)，有無取自體骨。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間數(shù)據(jù)差異的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，比較采用？字2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者各項(xiàng)觀察指標(biāo)比較 所有患者均獲得隨訪，隨訪6～15個(gè)月，治療組愈合率86.36%，有1例出現(xiàn)了骨延遲愈合，通過連續(xù)隨訪，12個(gè)月獲得了骨愈合。對(duì)照組骨折愈合率85.70%，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在手術(shù)時(shí)間、出血量、住院費(fèi)用、住院時(shí)間方面，對(duì)照組均高于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1；切口愈合方面，對(duì)照組有2例患者出現(xiàn)Ⅱ級(jí)愈合，治療組患者均為Ⅰ級(jí)愈合；有無取自體骨：治療組無一例取自體骨，對(duì)照組均取自體骨。

2.2典型病例 圖1中a、b、e、f為治療組術(shù)前骨不愈合的正側(cè)位片，c、d、j、k為采用組織工程化間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合PRP治療后6月正側(cè)位片，i、m為對(duì)照組術(shù)前的骨不愈合的正側(cè)位片，n、o為采用開放固定+有效植骨治療6個(gè)月后正側(cè)位片。

3 討論

從以上實(shí)驗(yàn)我們可以看到，組織工程化干細(xì)胞聯(lián)合PRP在治療骨不連中有優(yōu)越的效果，在保證骨折愈合率的基礎(chǔ)上，較我們傳統(tǒng)手術(shù)創(chuàng)傷小，出血少，減少了住院時(shí)間及住院費(fèi)用，減少取自體骨帶來的副損傷，傷口愈合好，是一種值得推廣的治療骨不連的方法。

骨不連通常被分為肥大性，骨膜性假關(guān)節(jié)，感染性，萎縮性骨不連等四種，肥大性骨不連局部血供較好，引起骨不連的原因主要是局部不穩(wěn)，影像學(xué)表現(xiàn)“象足征”或“抱球狀改變”。需牢固的內(nèi)固定一般可達(dá)到骨性愈合。滑膜性假關(guān)節(jié)是在骨折處形成一個(gè)充滿液體的滑囊腔，封閉了骨髓腔，打斷了遠(yuǎn)近端骨的連接通路，感染性骨不連需采取感染病灶清除，植骨或行骨延長等方法治療。萎縮性骨不連表現(xiàn)為周圍瘢痕組織替代骨痂，骨折端血供或骨活性較差，有時(shí)表現(xiàn)為骨吸收[7，8]。骨不連有時(shí)不是單純的一種因素導(dǎo)致的，可能同時(shí)合并有好幾種。所以針對(duì)骨不連，在改善穩(wěn)定和血供的基礎(chǔ)上，改善成骨活性和增加骨愈合的能力會(huì)極大的改善骨不連的治愈成功率[9]。

骨不連的傳統(tǒng)治療方法為開放固定+有效的植骨，此有效的植骨多選擇自體骨，自體骨有良好的支撐性及骨誘導(dǎo)性，同時(shí)有骨髓細(xì)胞，因而成骨效果好，是良好的植骨材料，但因自體骨數(shù)量有限，增加創(chuàng)傷，增加手術(shù)時(shí)間及并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，尤其不適用兒童及年老體弱者[10]。傳統(tǒng)的開放手術(shù)切口大，失血多，增加感染風(fēng)險(xiǎn)，延長了住院時(shí)間及住院費(fèi)用。隨著分子生物學(xué)及組織工程學(xué)的發(fā)展，有沒有一種更有效、更微創(chuàng)、更節(jié)約的一種治療骨不連的方法呢？組織工程化間充質(zhì)干細(xì)胞、PRP的研究給我們帶來了希望。國內(nèi)外文獻(xiàn)表明，臨床在治療骨不連方面取得了不錯(cuò)的效果[11]，但都僅限于一種方法治療骨不連。我們將兩種方法聯(lián)用，取得了不錯(cuò)的療效。從理論上分析，外周血干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞來源于中胚層，具有多項(xiàng)分化的潛能，在特定的理化條件與細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，可定向的向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化[12]。PRP是在血小板裂解同時(shí)釋放大量細(xì)胞因子，細(xì)胞因子可誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[13]和促進(jìn)組織血管化，所以干細(xì)胞有效的解決了成骨種子細(xì)胞的問題，PRP促進(jìn)了骨誘導(dǎo)及加速成骨問題，同時(shí)PRP裂解產(chǎn)生的細(xì)胞因子可促使白細(xì)胞向局部轉(zhuǎn)移，加強(qiáng)了局部的抗感染性，有效的防止傷口感染[14]。

干細(xì)胞或PRP治療都存在不能有效固化在治療部位和活性成分流失的問題，在本研究中，我們加入凝血酶從而使血漿中的纖維蛋白原形成纖維蛋白凝膠，形成自體組織工程支架材料使干細(xì)胞和細(xì)胞因子固化在骨折斷端，避免了流失，為干細(xì)胞成骨提供一定的支撐，促使其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，同時(shí)凝血酶還可迅速裂解血小板，使血小板中的細(xì)胞因子大量釋放，進(jìn)一步促進(jìn)修復(fù)效應(yīng)。

雖然組織工程化干細(xì)胞及PRP在治療骨不連方面有巨大的潛力，但還有一些問題需要進(jìn)一步研究[15]。①本研究中的干細(xì)胞為體內(nèi)動(dòng)員，而更大量的間質(zhì)干細(xì)胞獲取有待于體外擴(kuò)增和培養(yǎng)，對(duì)技術(shù)要求較高，且目前僅限于臨床研究階段，但貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院已是首批國家衛(wèi)計(jì)委和藥監(jiān)局批準(zhǔn)的干細(xì)胞臨床研究機(jī)構(gòu)，后續(xù)研究正在申請(qǐng)備案并開展；②組織工程化干細(xì)胞誘導(dǎo)、與可吸收生物材料的符合構(gòu)建還需進(jìn)一步的研究；③PRP釋放的細(xì)胞因子數(shù)量，種類巨多，在細(xì)胞因子分類及作用機(jī)理研究方面還有待深入研究。

總之，造成骨不連的因素不只是單純的一種因素，在治療骨不連時(shí)，有效的固定，良好的血運(yùn)，作為種子細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞，加速干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的PRP都是治療骨不連的確切有效的方法。只有在滿足這些條件的情況下，才會(huì)大大提高骨不連的治療效果。

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收稿日期：2018-3-20；修回日期：2018-3-30

編輯/成森