小兒急性淋巴細胞白血病亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性及甲氨蝶呤血藥濃度監測的意義

陳麗萍，吳云波，劉 靜

急性淋巴細胞白血病 （acute lymphoblastic leukemia，ALL）在兒童白血病中最為常見，而甲氨蝶 呤 （Methotrexate，MTX） 用 于 臨 床 治 療 兒 童ALL，是緩解后治療的關鍵藥物之一。目前的研究證實，全身應用常規劑量的MTX不易透過血腦、血睪屏障，腦脊液中MTX的濃度很低。而增加MTX的劑量可以明顯提高血液和腦脊液的藥物濃度［1］。但隨之會帶來一些不良反應，包括口腔潰瘍、胃腸道黏膜損害、白細胞不同程度下降及肝腎功能不全等。筆者對41例ALL患者大劑量甲氨蝶呤（highdose methotrexate，HDMTX）化療時亞甲基四氫葉酸還 原 酶 （methylene tetrahy drofolate reductase，MTHFR）基因多態性以及血藥濃度監測數據進行統計分析，并觀察其在應用HDMTX后的不良反應，為MTX個體化用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月—2016年1月某院血液科收治的ALL小兒患者41例，男26例，女15例；年齡1～12歲，平均6.3歲。其中41例患者經骨髓細胞形態學與免疫組化檢驗并符合臨床急性淋巴細胞白血病診斷標準，且處于緩解期。

1.2 研究方法

1.2.1 甲氨蝶呤治療方法 41例患者均予以VDLP方案誘導緩解治療，以CAM方案［環磷酰胺（CTX）、阿糖胞苷（Ara－C）、6－巰基嘌呤（6－MP）］鞏固治療，達到完全緩解后，經檢測血象指標達到：粒細胞＞1.5×109/L，白細胞≥3×109/L，血紅蛋白＞90 g/L，血小板＞100×109/L，同時肝腎功能指標均正常。此時開始采用大劑量 MTX＋亞葉酸鈣 （calciumfoli－nate，CF）方案進行髓外白血病的預防性治療基因型為CC的ALL患者，使用MTX 3 g/m2；基因型為CT和TT的ALL患者，增加四氫葉酸鈣解救次數。其治療方案如下：（1）給予緩解期每療程MTX總量的1/6（每次不超過500 mg）作為突擊量，30 min內快速靜脈滴入；余 5/6量，于23.5 h內勻速持續靜脈滴入。（2）停止滴注MTX 12 h后用亞葉酸鈣解救，15 mg/m2·次，6 h/次，共 6～8次。 （3）患者化療期間合并用藥：給予磷酸肌酸鈉保護心肌功能；多烯磷脂酰膽堿促進受損的肝功能和酶活力恢復正常，調節肝臟的能量平衡，促進肝組織再生；鹽酸托烷司瓊阻斷嘔吐反射過程中神經介質的化學傳遞，治療對化療及放療引起的嘔吐。

1.2.2 甲氨蝶呤基因檢測 開始采用大劑量MTX沖擊治療前抽取患者靜脈血2 ml，EDTA抗凝，使用基因組DNA抽提試劑盒 （北京天根公司）提取DNA。 MTHFR（677C＞T）多態位點采用凱杰公司的焦磷酸檢測技術進行檢測。使用北京博邁德公司的PCR試劑配擴增反應液，引物由凱杰公司提供的軟件進行設計，再由上海生工合成。PCR條件：95℃3 min，（95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）×45 個循環。PCR完成后用焦磷酸測序儀（PyroMark Q96 ID）進行測序分型。

1.2.3 甲氨蝶呤血藥濃度監測 大劑量MTX開始滴注后48 h、72 h采對側上肢靜脈血2 ml，應用TDX熒光偏振免疫分析儀（FPIA，美國雅培公司）檢測MTX血藥濃度。MTX試劑由雅培公司提供。直至血藥濃度達0.1μmol/L以下時停止監測和解救。

1.2.4 觀察指標 觀察所有患者不同基因多態性以及MTX血藥濃度水平，其發生不良反應包括骨髓抑制、肝腎損害、皮膚損害、惡心嘔吐等的比例，比較其差異。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件包進行統計分析，MTHFR基因型與不良反應關系的分析采用頻數分布，組間比較采用 χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者接受MTX藥物相關基因檢測制定個體化治療方案前后不良反應比較 41例ALL患者未經過藥物相關基因檢測前，常規用藥出現骨髓抑制3例次，消化道癥狀6例次，肝功能損害3例次，口腔黏膜損害9例次，惡心嘔吐6例次，發生不良反應16例，不良反應發生率為39.0%。根據藥物相關基因檢測結果進行個體化增加亞葉酸鈣解救頻次，患者出現骨髓抑制1例次，肝功能損害1例次，消化道癥狀3例次，口腔黏膜損害4例次，惡心嘔吐6例次。有患者11例發生不良反應，不良反應發生率為 26.8%。

基因檢測測定調整個體化用藥前后比較，χ2=9.409，P=0.002，差異有統計學意義（P＜0.05）。 該項研究結果顯示，使用大劑量MTX時，不良反應的發生率分別為 CC 占 35.7%，CT 占 45%，TT 占 85.7%，即基因型為CT和TT的ALL患者對藥物敏感性增加，耐受性降低，發生不良反應的風險較CC型的高。由此可見，適當降低MTX的用量或增加解救藥物（亞葉酸鈣）的使用劑量，可減少不良反應。見表1。

表1 MTHFR基因型與不良反應的關系

2.2 患者血藥濃度監測情況及個體化用藥前后不良反應比較 目前，公認的MTX中毒血藥濃度為：給藥后 24 h＞10 μmoL/L，48 h＞1 μmoL/L，72 h＞0.1 μmoL/L，若在給藥 48 h 后血藥濃度＞0.25 μmoL/L，則應加大解救劑量，增加解救次數，使72 h后血藥濃度低于 0.1 μmoL/L［2］。該研究中，治療組患者采用大劑量MTX治療，藥物基因檢測前，患者48 h血漿 MTX 濃度＞1μmoL/L者 4例，占 9.8%；患者經藥物基因檢測并增加亞葉酸鈣解救劑量及頻次，48 h后血漿 MTX 濃度＞1μmoL/L者 1例，僅占 2.4%；患者給藥后72 h血藥濃度均低于0.1μmoL/L。

3 討論

ALL是臨床常見惡性血液系統疾病，多見于小兒，起病隱匿、進展迅速。甲氨蝶呤是用于兒童急性淋巴細胞白血病治療的常用藥物，大劑量沖擊療法的廣泛應用，明顯降低髓外白血病的發生，提高了患者的長期生存率。但值得注意的是由于患者的基因多態性造成不同個體對MTX的敏感性及耐受性有很大差異。MTX是一種葉酸還原酶抑制劑，5，10－MTHFR是葉酸－甲硫氨酸代謝的關鍵酶，其導致DNA的生物合成受到抑制，治療中常常發生各種不良反應，主要表現為黏膜損害、肝功能異常及骨髓抑制等［3］。其基因中677位核苷酸由胞嘧啶（C）突變為胸腺嘧啶（T），使得酶的活性降低，改變細胞內活性葉酸成分的分布［4］，可能使機體對MTX的敏感性增強，增加ALL患者對MTX的不良反應［5］。許宏等［6］報道的MTX在MTHFR 677CT基因型體內代謝緩慢，24 h MTX血藥濃度較高，這很好地解釋了MTHFR的基因多態性與MTX治療時不良反應之間的關系。即MTHF R677C＞T可以增加MTX治療的不良反應的發生率。研究表明，ALL與MTHFR基因型突變相關［7］。變異基因攜帶者對甲氨蝶呤更為敏感，對藥物不良反應的耐受性降低，在使用大劑量藥物時，這種情況可能會更為明顯，可產生嚴重不良反應。臨床藥師將臨床藥學和藥物基因組學結合，從基因組水平上深入認識疾病及藥物作用的個體差異的機制。對急性淋巴細胞白血病患者HDMTX化療期間，根據檢測MTHFR基因型進行個體化治療，患者藥物基因檢測前，患者48 h血漿MTX濃度＜0.25 μmoL/L 者 37 例，占 90.2%；血漿 MTX 濃度＞1μmoL/L者 4例，占 9.8%；不良反應發生率為39.0%，經過藥物相關基因檢測后，增加亞葉酸鈣解救次數，患者48 h血漿MTX濃度＜0.25μmoL/L者40例，占97.6%；血漿 MTX濃度＞1μmoL/L者1例，占2.4%；出現不良反應發生率為26.8%。基因檢測測定調整用藥前后比較，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。有效地減少患者嚴重的不良反應的發生。

綜上所述，大劑量MTX治療兒童急性淋巴細胞白血病患者通過對MTHFR的基因檢測，了解患者對MTX毒性風險的高低，對風險較高，則需實施個體化給藥，嚴格治療規范，提早預防其不良反應的發生。出現不良反應時，及時采取相應措施，積極處理。同時血漿MTX濃度監測下，用亞葉酸鈣補救，為臨床與患者建立新型的臨床藥學模式。