不銹鋼網對臍帶間充質干細胞貼壁及增殖數量影響的實驗研究

高健偉，郭紅燕，呂昕剛

自從人臍帶間充質干細胞出現以來，逐漸成為人們的研究熱點；但干細胞的培養擴增還存在較多問題，很多因素都可以導致原代干細胞體外培養失敗（如選擇培養基、血清、臍帶質量、無菌情況、技術操作等等情況），即使成功培養MSCs也會出現生長不良，數量少等情況，影響實驗效果及結果。筆者采用事先預制好的不銹鋼絲網置入貼壁后的臍帶組織中進行原代培養，觀察細胞貼壁的效果和細胞生長情況以及形態變化，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 不銹鋼網（市售，型號304，規格1 mm×1 mm×1 mm），DMEM/F12（HyClone）（圖 1），青霉素和鏈霉素 100×（Solabio），15%FBS（Gibco），培養皿（美國康寧），倒置顯微鏡（100×），熒光倒置顯微鏡（100×），細胞計數板。

圖 1 預制不銹鋼網

1.2 培養皿孔數和不銹鋼網的處理 全部采用6孔培養板，所有培養板只能用同一種培養基，共2板，1孔為一份標本，共12份標本。不銹鋼網常規洗潔精清洗3遍，放入數控超聲儀內超聲處理30 min，清水再沖洗3～5遍，最后純水沖洗3遍烘干，高壓無菌滅菌鍋消毒備用。

1.3 培養觀察時間 時間觀察點分別是7 d，10 d，15 d，20 d，25 d，記錄細胞游出數量情況和細胞形態的變化情況。

1.4 臍帶采集和培養 人臍帶間充質干細胞原代培養采用組織塊貼壁法進行，分為：A組為正常培養組，B組為置入不銹鋼網組。選用足月、健康產婦的新鮮、無菌的新生兒臍帶長約15 cm，用無菌4℃恒溫盒儲存運輸，即刻消毒，用PBS（含1∶1000的青霉素和鏈霉素）反復沖洗表面血跡和血管內血跡，清洗徹底干凈，隨后用組織剪剪取干凈、清亮、飽滿部分的臍帶，每一段長約1 cm，挑選取用12段用PBS再次反復沖洗。沖洗干凈后用血管鉗和眼科剪細心分離先將臍帶靜脈和動脈去除，然后去除羊膜，剩余即為華通膠。取無菌一次性培養皿用眼科剪將華通膠一般剪成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，平均分別種在一次性無菌6孔的培養板底部，隨后把培養板放在37℃，5%CO2恒溫孵育箱中1.5～2.5 h。1.5～2.5 h 后取出在超凈操作臺上，A 組用加液器緩慢小心加入DMEM/F12培養液 （含1∶100的青霉素和鏈霉素）；B組在組織塊上方置入無菌的不銹鋼網，將組織塊適量輕觸壓住，然后小心加入DMEM/F12培養液 （含1∶100的青霉素和鏈霉素）。倒置顯微鏡下觀察未見異常后置于37℃，5%CO2恒溫孵育箱內培養，分時間階段計數細胞數量。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。 計量資料以（x±s）表示，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞計數情況 在相同的培養條件下，采用足月、健康產婦的新鮮、無菌、健康的新生兒臍帶。以每厘米臍帶培養進行比較計數，6孔培養板置倒置顯微鏡上觀察細胞形態及結構變化；同時用細胞計數板進行計數并記錄結果。A組和B組之間對比對細胞數量分析差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同培養基細胞計數（每 cm 臍帶，A 組：×104/cm，B 組：×106/cm）

2.2 人臍帶MSCs形態學特性 人臍帶華通膠行組織塊貼壁法，DMEM/F12培養液培養，進行連續不同時間階段觀察發現［1，2］。兩組共同點：形態均一，呈條索狀或菱形生長，體積較大，大多數平行生長。兩組不同點：A組鏡檢發現干細胞貼壁稀疏，細胞融合及細胞排列松散，細胞層數少［3，4］；B 組發現細胞貼壁時間短，增值快，細胞生長旺盛，數量明顯增多，細胞融合及細胞排列緊密感明顯，多數可出現多層細胞。見圖2～7。

圖2 A組單純DMEM/F12培養

圖 3 B組不銹鋼網加DMEM/F12培養

圖 4 A組培養7 d（熒光倒置顯微鏡10×）

圖 5 B組培養7 d（熒光倒置顯微鏡10×）

圖 6 A組培養15d（熒光倒置顯微鏡40×）

圖 7 B組培養15 d（熒光倒置顯微鏡40×）

2.3 不銹鋼網對原代細胞培養的影響 通過兩種方式進行原代干細胞培養發現：B組細胞原代培養獲得干細胞數量比A組要多；細胞生長速度迅速和體外增殖擴增較快，結構形態一致性強，不銹鋼網對原代干細胞培養無形態學影響［1］。對A、B兩組行細胞爬片熒光染色熒光倒置顯微鏡觀察：細胞形態結構對比無異常圖（圖 8，9）。

圖 8 A組爬片（熒光倒置顯微鏡40×）

圖 9 B爬片（熒光倒置顯微鏡40×）

3 討論

人臍帶間充質干細胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）由臍帶的華爾通膠或叫沃頓膠（Whartoncs jelly，WJ）經貼壁處理培養所得，是具有自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，在脊髓損傷治療過程中參與神經的修復，促進多種有利因子的產生，在脊髓組織內可以進行遷移、整合、調節、分泌等作用，在脊髓損傷的修復治療方面較其他干細胞治療更具有明顯優勢［5-12］，成為目前干細胞實驗研究和臨床研究的焦點和熱點。但干細胞的培養擴增還存在較多問題，很多因素都可以導致原代干細胞體外培養失敗（如選擇培養基、血清、臍帶質量、無菌情況、技術操作等），即使成功培養MSCs也可出現生長不良，數量少，收集困難等情況影響實驗效果。

該實驗主要是討論如何促進組織貼壁，如何獲得和增加干細胞的數量。既往人們為了促進組織貼壁大部分采用各種貼壁因子試劑在培養板內進行涂抹，如增加多聚賴氨酸、明膠、鼠尾膠、肝素、谷氨酰胺、硅膠、凝膠、粘連纖維蛋白、地塞米松、氫化可的松等［1，11，13，14］，即使使用上述試劑，仍使干細胞數量較少，其生長緩慢等情況出現，同時因為操作技術和價格高等問題限制其應用，導致實驗結果不理想，細胞數量不足；于是采用事先預制好的不銹鋼網壓住臍帶組織塊防止飄浮進行體外原代培養，可以獲得大量的干細胞，解決了細胞數量來源不足和細胞培養困難等問題。

在培養過程中不同時間段A、B兩組放于倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡下觀察發現B組細胞生長形態良好，細胞生長迅速，細胞體積明顯增大，集落群體明顯，細胞密集，形態均一，細胞狀態良好，生長旺盛，體外增殖較快等多種優點［11，15，16］。 通過以上A、B兩組觀察形態結構未見明顯異常，形態學一致。

市售不銹鋼網型號304，規格1 mm×1 mm×1 mm大小，市場銷售較多，價格便宜，實用方便，操作簡便易學，無腐蝕銹斑，是進行干細胞貼壁培養的良好材料，為實驗研究和臨床研究解決了細胞數量來源不足等問題，在早期細胞貼壁培養過程中起到了關鍵作用。