胰島素樣生長因子結合蛋白5對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響＊

王利娟，支運來

高血壓是心血管疾病的一種，目前高血壓的治療主要是采用藥物治療，藥物治療只能暫時控制血壓的升高，并不能根本改變高血壓的發生、發展。近年來關于高血壓發病機制的研究已經證實其與血管重構密切相關，血管重構使得大動脈發生病變，是高血壓發生、發展的重要病理基礎。細胞增殖，遷移，以及體積的增大和基質的重新合成，重新排列導致了血管重構［1］。血管重構最典型的特征是血管平滑肌細胞過度增殖和肥大，腔徑縮小，血管壁單位面積受到的壓力增大即血壓升高。因此，能夠引起血管平滑肌細胞過度增殖或肥大的因素都可能影響高血壓的發病。

目前有關胰島素樣生長因子結合蛋白5（insulin-like growth factor binding protein-5，IGFBP-5）的研究主要集中在其對癌細胞過度增殖的作用［2］，也有研究證明，它對正常的組織細胞具有促增殖，凋亡和組織重構的作用［3］。IGFBP-5在心血管疾病的研究中甚少，該研究主要分析IGFBP-5過度表達與高血壓大鼠血管重構之間的關系，旨在進一步探討IGFBP-5引起血管平滑肌細胞過度增殖的分子機制，為高血壓的治療提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 VSMCs的培養和鑒定 取4周齡、雌性、體重200～250 g的SHR和WKY稱重后用2%的苯巴比妥腹腔注射麻醉，用眼科剪取胸主動脈，縱向剪開血管，小心刮去血管內膜。把主動脈剪成1 mm×1 mm的小塊放入到培養瓶的底部，用20%FBS的DMEM培養基培養，待顯微鏡下觀察有細胞長出時換液。鏡下觀察細胞為長梭形，即為血管平滑肌細胞。細胞長滿培養瓶時用0.25%胰酶消化傳代，用3－7代的VSMV進行后續實驗。

1.2 免疫印跡法檢測蛋白表達 參照FERMENTAS公司BCA蛋白測定試劑盒使用步驟說明書，提取各組全細胞蛋白。配制SDS分離膠和濃縮膠電泳。以β－actin作為內參，內參表達一致，則表明上樣量均一。用Image J軟件分析蛋白條帶密度，以目的蛋白和內參密度的比值分析蛋白表達水平的變化。每組實驗重復6次。

1.3 MTT法檢測IGFBP-5的促細胞增殖作用

用濃度梯度為 0、50、100、200 ng/ml的 IGFBP－5 處理培養好的WKY細胞24 h后。每孔加入5 mg/ml MTT 20μl繼續培養4 h，棄上清，每孔加DMSO 150μl溶解藍色的甲瓚顆粒，多用酶標儀測定570 nm吸光度 （OD570）。設定對照組 OD570為100%，計算各實驗組的增長率。細胞增長率（%）=（實驗組吸光度/對照組吸光度）×100%。每組實驗重復5次

1.4 統計學分析 應用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗，三組以上均數比較進行單因素方差分析（one-way analysis of varience，ANOVA），用Turkey法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SHR和WKY兩種大鼠VSMC中IGFBP-5表達量的比較 如圖1A所示，與WKY組相比較SHR 組 IGFBP－5 的表達量顯著增高 （＊P＜0.05，n=6）。結果提示，SHR組IGFBP－5的高表達可能和高血壓的發生、發展有關。

2.2 IGFBP-5對VSMCs增殖的影響 如圖2所示，WKY組細胞的增殖率較空白組分別是25.9%，81.5%，＊P＜0.05；129.6%，＊＊P＜0.01。 結果提示，IGFBP－5對WKY組具有明顯的促VSMCs增殖的作用。

圖 1 Western Blot檢測WKY組和SHR組IGFBP-5表達量的變化

圖 2 不同濃度梯度IGFBP-5處理的WKY細胞24 h后MTT法檢測細胞增殖率

3 討論

目前有關IGFBP－5的研究主要集中于其在腫瘤中的作用，它的表達量不僅對腫瘤的預后和治療有重要影響而且還能對腫瘤的早期診斷具有重要意義［4］。在早期乳腺癌的診斷中，IGFBP－5 已經作為其中一個診斷指標被應用到臨床中［5］。在腫瘤中的研究證實，IGFBP－5既存在于細胞質中，也存在于細胞核中，該因子在不同位置發揮作用主要是作為轉錄子，促進某種基因的表達，從而發揮其促細胞增殖的作用，不同的細胞具體機制還尚不明確。有待于進一步的研究。

現有的研究表明，IGF－1能夠促進血管平滑肌細胞的增殖，而高血壓的發生主要體現在血管重構［6］。 IGF－1 和 IGFBP－5 同屬于 IGFs調節軸的組成部分，IGFBP－5是否是通過調節IGF－1來起到調節細胞增殖的是后續實驗將要解決的問題。有關IGF/IGFBP在心血管疾病中起到何種作用，科學界目前存在爭議，Ricketts曾報道，在健康的成年人體內IGF1和IGFBP-5的量對心血管疾病是沒有影響的［7］。 然而，Urbonaviciene等研究人員發現 IGF1和IGFBP-5在體內的表達量和早期動脈粥樣硬化發生有密切的關系，并且能夠影響到動脈粥樣硬化的發展［8］。 該實驗的研究結果顯示 SHR大鼠VSMCs中IGFBP-5的表達量顯著增高并且IGFBP-5能夠促進VSMCs的增殖，提示IGFBP-5的高表達和高血壓的發生密切相關同時為IGFBP-5可能夠促進高血壓的發展這一課題研究提供了新的論據。高血壓的發病機制復雜，可能與內分泌異常，遺傳因素，神經功能紊亂等多種因素密切相關，目前認為血管重構是高血壓靶器官損害的重要機制，因此探討血管重構的分子機制，是高血壓治療的關鍵靶點。

綜上所述，高血壓的發生和發展與IGFBP-5的表達上調密切相關，但還需進一步研究其具體機制。