青錢柳葉總黃酮檢測方法的研究

張學(xué)英 章發(fā)盛 黃靜 彭俊 張祖圓

摘 要：采用比色法測定青錢柳葉總黃酮（以蘆丁計）的含量。對三氯化鋁醋酸鉀和硝酸鋁2種比色法進行比較分析，確定三氯化鋁醋酸鉀比色法為青錢柳葉總黃酮最佳測定方法，該方法重現(xiàn)性好，精密度和加標(biāo)回收率高，其RSD分別為1.00%、2.87%和3.06%，4h內(nèi)顯色反應(yīng)體系穩(wěn)定性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Abs =0.2855×C -0.00281，相關(guān)系數(shù)為0.99926，在0.2～8.0ug/mL范圍內(nèi)符合朗伯比耳定律。本方法適用于青錢柳代用茶中總黃酮的質(zhì)量分析和質(zhì)控依據(jù)。

關(guān)鍵詞：青錢柳葉；總黃酮；三氯化鋁醋酸鉀比色法；硝酸鋁比色法；方法研究

中圖分類號：S-3 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180732001

青錢柳Cyclocarya paliurus （ Batal）Iljinsk）為胡桃科青錢柳屬植物，別名銅錢樹、搖錢樹、青錢李、金錢柳等，為我國特有樹種，屬國家二級保護樹種。主要生長于中國南部海拔 420～2500m 的高山地區(qū)，是一種藥食兩用的植物，其根、枝、葉均可入藥，可用作傳統(tǒng)中藥制劑。現(xiàn)代藥學(xué)研究表明青錢柳具有生津止渴、清熱解毒、降三高、抗氧化、提高人體免疫力等功效[1]。陳瑋玲等研究表明青錢柳中含有有機酸、酚酸、黃酮、三萜、皂苷類和酯類等，其中酚酸和黃酮類化合物是主要的抗氧化活性成分[2]。青錢柳葉在食品加工領(lǐng)域中作為新食品原料（中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會2013年第10號公告），一般用青錢柳嫩葉作為代用茶原材料，在我國湖南、江西等省份己有部分企業(yè)獲得青錢柳代用茶食品生產(chǎn)許可證（國家市場監(jiān)督管理總局網(wǎng)站可查詢）。

黃酮類化合物是一類植物中分布很廣而且重要的多酚類天然產(chǎn)物，泛指2個具有酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物[3]。黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗菌作用、抗氧化作用和抗自由基作用等[4]。

食源性植物、藥源性植物、保健食品和食品中總黃酮的測定方法主要有直接測定法、薄層色譜法、 高效液相色譜法、毛細管電泳法、紫外分光光度法等，高效液相色譜法常用于檢測黃酮單體，比色法常用于檢測總黃酮量，比色法一般快速、簡單、準(zhǔn)確，常用比色法（以蘆丁計）有直接比色法（360nm）、三氯化鋁比色法（312nm）、三氯化鋁比色法（416nm）[5] 、三氯化鋁醋酸鉀比色法（415nm）、硝酸鋁亞硝酸鈉氫氧化鈉比色法（510nm）等。經(jīng)查文獻資料，未見關(guān)于青錢柳葉中總黃酮三氯化鋁醋酸鉀比色法（本文簡稱三氯化鋁法）和硝酸鋁亞硝酸鈉氫氧化鈉比色法（本文簡稱硝酸鋁法）的比較研究。本文通過光譜掃描、方法評價等驗證，比較分析三氯化鋁比色法和硝酸鋁比色法在青錢柳葉總黃酮（以蘆丁計）檢測中的應(yīng)用，建立一套準(zhǔn)確、簡便、靈敏、重現(xiàn)性好的青錢柳總黃酮檢測方法，為青錢柳代用茶及其總黃酮的開發(fā)應(yīng)用提供檢測方法、應(yīng)用基礎(chǔ)和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器、試劑等試驗材料

1.1 儀器

UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津）；BSA-224S分析天平、電熱恒溫水浴鍋、KQ5200V型超聲波清洗器、常用玻璃器皿等。

1.2 試劑

醋酸鉀（AR，含量≥92.0%）；冰醋酸（AR，含量≥99.5%）；三氯化鋁（AR，含量≥99.0%）；硝酸鋁（AR，含量≥99.0%）；亞硝酸鈉（優(yōu)級純，含量≥99.0%）；氫氧化鈉（優(yōu)級純，含量≥98.0%）；無水乙醇（UV-HPLC，含量≥99.9%；AR，含量≥99.7%）；甲醇（HPLC，含量≥99.9%；AR，含量≥99.5%）；2.5g/100mL三氯化鋁（備注：本試驗所用自配試劑均表示為水溶液）；9.82g/100mL醋酸鉀； 10g/100mL硝酸鋁；5g/100ml亞硝酸鈉； 20g/100mL氫氧化鈉。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

以中藥對照品蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號153-18-4，含量98.41%，生產(chǎn)商：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅰ：稱取0.0100g干燥恒重蘆丁用95%乙醇溶解定溶至100mL容量瓶中，配成100ug/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅰ；標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅱ：標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅰ用95%乙醇稀釋5倍，配成20ug/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液Ⅱ。

1.4 試驗樣品

試驗樣品來源于湘食藥科[R201726]課題的科研樣品和古丈春風(fēng)合民族食品開發(fā)有限公司（青錢柳代用茶成品）。科研樣品為不同季節(jié)科研人員現(xiàn)場采摘鮮葉，在試驗室進行簡單加工：通風(fēng)陰干（陰干或160～180℃殺青15min后陰干）→60℃恒溫復(fù)干1h→粉碎過60目篩。

2 實驗方法及驗證

2.1 基礎(chǔ)試劑驗證

2.1.1 實驗用水驗證

用UV-2550儀對檢驗用純凈水和超純水進行200～700nm波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種水在掃描波長范圍內(nèi)均無明顯吸收峰，且2種試驗用水在220～700nm光譜圖平直一致。可見試驗用純凈水和超純水對本試驗無影響。即本試驗用純凈水即可。

2.1.2 實驗用有機溶劑驗證

通過驗證甲醇（液相色譜純原液、AR市售原液、90%AR自配、70%AR自配）和乙醇（液相色譜純原液、AR市售原液、95%市售原液、90%AR自配、60%AR自配、30%AR自配）200～700nm波長掃描，結(jié)果為乙醇（6種）和甲醇（液相色譜純原液）在220～700nm均無明顯吸收峰，且光譜圖平直一致見圖1和圖2。但甲醇（AR市售原液、90%AR自配、70%AR自配）在260～265nm處有較小的吸收峰見圖2。綜合考慮試劑對本試驗的影響、甲醇有機溶劑的毒性及液相色譜純試劑成本等因素。故本試驗有機溶劑選擇AR及自配的不同濃度乙醇較佳。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品紫外鑒別[6]