PAQR3基因在胃癌組織中的甲基化狀態(tài)及其臨床意義

陶利萍　　金尹　　胡暢遠(yuǎn)　　陳旭艷

[摘要] 目的 探討孕酮和脂聯(lián)素受體3（Progestin And Adipo Q Receptor Ⅲ，PAQR3）基因在胃癌組織中的甲基化狀態(tài)及其臨床意義。 方法 收集2015年3～9月經(jīng)病理確診的原發(fā)性胃癌及癌旁組織45對(duì)，采用甲基化特異性PCR法檢測(cè)PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，免疫組化法檢測(cè)PAQR3蛋白的表達(dá)，并分析其與患者腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系。 結(jié)果 胃癌組織中PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化率（44.44%，20/45）顯著高于癌旁組織（8.89%，4/45，P<0.001），而PAQR3蛋白表達(dá)則較癌旁組織顯著降低，兩者間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.478，P<0.01）。PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化率及PAQR3蛋白的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)（P<0.01）。 結(jié)論 PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是引起胃癌組織PAQR3表達(dá)降低的重要原因，有望成為胃癌病情和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)記物以及表觀遺傳學(xué)治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] PAQR3；甲基化；胃癌；表達(dá)

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）17-0009-04

Methylation status of PAQR3 gene in gastric cancer and its clinical significance

TAO Liping1 JIN Yin1 HU Changyuan2 CHEN Xuyan1

1.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China；2.Department of Gastrointestinal Surgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the methylation status of Progestin And AdipoQ Receptor III （PAQR3）gene in gastric cancer and its clinical significance. Methods Forty-five pairs of primary gastric cancer and paracancerous tissues confirmed by pathology from March to September 2015 were collected. Methylation-specific PCR was used to detect the methylation level of PAQR3 gene promoter. Immunohistochemistry was used to detect protein of PAQR3 expression and analyzed its relationship with the clinicopathological features of patients' tumors. Results The methylation rate of PAQR3 gene promoter was significantly higher in gastric cancer tissues（44.44%， 20/45） than that in paracancerous tissues（8.89%， 4/45， P<0.001）， while the expression of PAQR3 protein was significantly lower than that in adjacent tissues. There was a negative correlation between the methylation rate of PAQR3 and the expression of PAQR3 protein（r=-0.478， P<0.01）. The methylation rate of PAQR3 promoter and the expression of PAQR3 protein were correlated with tumor invasion depth， lymph node metastasis and TNM stage（P<0.01）. Conclusion The hypermethylation of PAQR3 gene promoter region may be an important cause of the decrease of PAQR3 expression in gastric cancer tissues and may be a molecular marker and epigenetic target for the evaluation of the prognosis of gastric cancer.

[Key words] PAQR3；Methylation；Gastric cancer；Expression

胃癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生存壽命及生活質(zhì)量，據(jù)國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2014年我國(guó)胃癌發(fā)病率在男性及女性中分別占第二和第四位，而死亡率更是均高居第二位[1]，因此研究胃癌相關(guān)基因的作用機(jī)制及其臨床意義對(duì)胃癌的防治具有重要的臨床價(jià)值。胃癌的發(fā)病與基因的異常表達(dá)密切相關(guān)，其機(jī)制包括基因突變及表觀遺傳學(xué)調(diào)控，而DNA的甲基化改變是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要內(nèi)容，其中抑癌基因啟動(dòng)子的高甲基化被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生的重要原因[2，3]。孕酮和脂聯(lián)素受體3（progestin and adipo Q receptor Ⅲ， PAQR3）是一類新命名的跨膜蛋白家族的成員，在能量代謝、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4，5]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)PAQR3蛋白的表達(dá)在胃癌組織中顯著下降，是影響胃癌的惡性度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等的一個(gè)新的關(guān)鍵蛋白[6]。但目前尚無(wú)PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與胃癌的相關(guān)研究報(bào)道，因此本研究擬了解PAQR3基因在胃癌組織中的甲基化狀態(tài)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年3～9月在我院經(jīng)手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的胃癌患者45例，其中男26例，女19例，年齡33～75歲，平均（56.2±8.1）歲。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及生物靶向等治療，同時(shí)排除合并其他腫瘤或胃息肉。每例患者均取癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織，手術(shù)切除半小時(shí)內(nèi)完成標(biāo)本收集，一份標(biāo)本臨時(shí)保存于液氮內(nèi)，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱內(nèi)保存；另一份標(biāo)本由福爾馬林固定后按常規(guī)制作蠟塊保存。同時(shí)收集患者的臨床及病理資料，確定TNM分期、組織學(xué)分化、腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化 將患者癌組織及癌旁組織蠟塊進(jìn)行切片，常規(guī)免疫組化染色，一抗?jié)舛葹?∶50（美國(guó)Santa Cruz），待切片顯色后適時(shí)終止反應(yīng)，以細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性PAQR3顆粒為陽(yáng)性，具體以半定量法判斷：①陽(yáng)性細(xì)胞率（記為a）：取每張切片5個(gè)隨機(jī)高倍視野下計(jì)數(shù)100個(gè)此類細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)記為百分比：≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>76%計(jì)4分；②染色強(qiáng)度（記為b），以多數(shù)細(xì)胞的染色強(qiáng)弱計(jì)分：無(wú)明顯著色0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；③a×b乘積為總評(píng)分，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。由于正常組織中PAQR3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率及強(qiáng)度均較高，PAQR3蛋白表達(dá)下降率定義為蛋白表達(dá)（-）與（+）之和占總例數(shù)的百分比。

1.2.2 甲基化特異性PCR 將-80℃冰箱保存的組織標(biāo)本研磨后，蛋白酶K消化，采用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度，亞硫酸鹽修飾并脫鹽純化回收，最后MSP法檢測(cè)PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化引物，分別用于擴(kuò)增PAQR3基因CpG島甲基化和非甲基化的等位基因。PAQR3甲基化引物（PAQR3-M）：上游為5-TTGTTGAAGAGCGCGTATTATATC-3，下游為5- TAAAAACCCGAAAATCTACTCGTA -3，擴(kuò)增片段約109bp大小。PAQR3非甲基化引物（PAQR3-U）：上游為：5-TTGTTGAAGAGTGTGTATTATATTGA-3，下游為5-TAAAAAACCCAAAAATCTACTCATA -3，擴(kuò)增片段約110bp大小。PCR反應(yīng)條件為95℃，5 min；95℃，10 s，60℃，32 s，40個(gè)循環(huán)；95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，15 s。擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁組織中PAQR3蛋白表達(dá)及PAQR3基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)

免疫組化結(jié)果顯示PAQR3蛋白主要定位于細(xì)胞胞漿內(nèi)。在45例胃癌組織中，19例PAQR3蛋白表達(dá)（-），5例表達(dá)（+），15例表達(dá)（++），6例表達(dá)（+++），而在45例正常胃上皮組織中，4例PAQR3蛋白表達(dá)（-），3例表達(dá)（+），15例表達(dá)（++），23例表達(dá)（+++）。胃癌組織中PAQR3蛋白表達(dá)下降率為53.33%，而相應(yīng)癌旁組織中表達(dá)下降者僅占15.56%，兩組間存在顯著差異（P<0.001）。見(jiàn)表1。

MSP結(jié)果顯示胃癌組織中PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率為44.44%，而癌旁組織中僅8.89%，兩者之間存在顯著差異（P<0.001），胃癌組織中PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率較癌旁組織顯著升高。

2.2 胃癌組織中PAQR3蛋白表達(dá)及PAQR3基因甲基化與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中PAQR3蛋白的表達(dá)下降與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)（P<0.05），與患者性別、年齡、組織學(xué)分化無(wú)關(guān)，與腫瘤大小可能相關(guān)，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.113）。胃癌組織PAQR3蛋白的表達(dá)在腫瘤浸潤(rùn)性高（T3～T4）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期高（Ⅲ～Ⅳ）的患者中較腫瘤浸潤(rùn)性低（T1～T2）、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期低（Ⅰ～Ⅱ）的患者中顯著降低（P<0.05）（表2）。PAQR3蛋白表達(dá)量與患者腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期之間的Spearman相關(guān)系數(shù)分別為-0.373、-0.418、-0.443（P<0.05）。

胃癌組織中PAQR3基因甲基化率與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)（P<0.05），與患者性別、年齡、組織學(xué)分化無(wú)關(guān)，與腫瘤大小可能相關(guān)，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.066）。胃癌組織PAQR3基因甲基化率在腫瘤浸潤(rùn)性高（T3～T4）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期高（Ⅲ～Ⅳ）的患者中較腫瘤浸潤(rùn)性低（T1～T2）、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期低（Ⅰ～Ⅱ）的患者中顯著升高（P<0.05）（表2）。PAQR3基因甲基化率與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期之間的Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.312、0.365、0.337（P<0.05）。

2.3 胃癌組織中PAQR3蛋白表達(dá)量與PAQR3基因甲基化之間的相關(guān)性

24例PAQR3蛋白降低的胃癌患者中，17例存在PAQR3基因甲基化，而21例PAQR3蛋白正常的患者中，僅有4例存在PAQR3基因甲基化。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中PAQR3蛋白表達(dá)量與PAQR3基因的甲基化之間存在顯著負(fù)相關(guān)，Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.478（P<0.01）。見(jiàn)表3。

3 討論

DNA甲基化是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一，主要由廣泛的低甲基化和局部高甲基化引起[8]。很多研究顯示抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化可導(dǎo)致相應(yīng)抑癌基因的表達(dá)減少，對(duì)腫瘤的抑制作用減弱從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-11]。甲基化檢測(cè)是腫瘤早期診斷、預(yù)后判斷和靶向治療的理想工具。近年來(lái)，基于基因甲基化檢測(cè)的精準(zhǔn)醫(yī)療及液體活檢等技術(shù)在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷及術(shù)后的隨訪監(jiān)測(cè)等方面得到了越來(lái)越多的應(yīng)用和肯定。因此，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和研究抑癌基因在胃癌中的甲基化狀態(tài)及其臨床意義有著重要的臨床價(jià)值。

PAQR3是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的抑癌基因，又名高爾基體Raf激酶錨定蛋白，是PAQR家族（progesterone and adipo Q receptor family）的一員，該基因定位于人的4號(hào)染色體上（4q21.21），編碼37 kDa左右的膜蛋白[12，13]。近年的研究顯示PAQR3在多種腫瘤中表達(dá)降低，包括結(jié)直腸癌[14]、乳腺癌[7]、肝癌[15]、肺癌[16]等，并與腫瘤的組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后等有著不同程度的相關(guān)性。PAQR3通過(guò)對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的調(diào)控，從而影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，并參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[17]。2014年梁曉輝等[16]的報(bào)道顯示胃癌組織中PAQR3基因的mRNA及蛋白的表達(dá)量較癌旁組織顯著下調(diào)，且與幽門螺桿菌的感染程度、腫瘤大小、分期、脈管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者的存活率有關(guān)。PAQR3可以通過(guò)調(diào)節(jié)ERK和AKT介導(dǎo)的信號(hào)通路及調(diào)控Twist1的水平影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6，18]，Qiao S等[19]的體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PAQR3可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移能力。這些研究顯示PAQR3可能成為胃癌發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)突破點(diǎn)，但目前PAQR3基因表達(dá)沉默的機(jī)制并不清楚，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化在胃癌中的表達(dá)情況。

本研究的結(jié)果顯示：胃癌組織中PAQR3蛋白表達(dá)量較癌旁組織顯著下調(diào)，且與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，而與患者性別無(wú)關(guān)，與Ling ZQ等[6]的研究結(jié)果相同。相較而言，本研究未顯示PAQR3蛋白表達(dá)量與患者年齡、腫瘤組織學(xué)分化的相關(guān)性，可能與納入的病例數(shù)、研究人群及地域等不同有關(guān)。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示胃癌組織中PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率較癌旁組織顯著升高，且與PAQR3蛋白的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，提示PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是引起胃癌組織中PAQR3蛋白表達(dá)量減少或沉默的重要原因。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示胃癌組織中PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與腫瘤的浸潤(rùn)深度、分期、淋巴侵犯相關(guān)，提示PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與胃癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，有可能成為判斷胃癌病情及預(yù)后的分子指標(biāo)。目前僅有的數(shù)篇PAQR3基因甲基化的文獻(xiàn)顯示PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)在前列腺癌組織、結(jié)直腸癌組織及乳腺癌組織中較相應(yīng)的對(duì)照組存在高甲基化，且分別與前列腺癌的神經(jīng)束侵犯、結(jié)直腸癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[7，14，20]，與本研究的結(jié)果類似，提示PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可作為腫瘤病情判斷及預(yù)后隨訪的候選指標(biāo)。Chen J等[7]的研究還顯示在乳腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)PAQR3可抑制細(xì)胞的侵襲和生長(zhǎng)，而去甲基化藥物處理可恢復(fù)乳腺癌細(xì)胞中PAQR3蛋白的表達(dá)并抑制其細(xì)胞增殖與侵襲，從而進(jìn)一步說(shuō)明PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是PAQR3蛋白表達(dá)減少或沉默的重要原因，同時(shí)指出PAQR3基因去甲基化治療的潛在意義。當(dāng)然，抑癌基因的表達(dá)沉默常涉及多種機(jī)制，本研究中24例PAQR3蛋白降低的胃癌患者中有7例無(wú)PAQR3基因甲基化，也提示PAQR3基因甲基化并非PAQR3蛋白表達(dá)降低的唯一原因，還有其他的基因沉默機(jī)制在發(fā)揮作用，如泛素化降解[19]等也可能參與PAQR3蛋白的調(diào)控，仍需要進(jìn)一步深入地研究。

總之，本研究顯示胃癌組織中PAQR3基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化，與PAQR3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并與胃癌的浸潤(rùn)深度、TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，胃癌組織中PAQR3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)是胃癌病情評(píng)估潛在的分子指標(biāo)及可能的治療靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Chen WQ，Li H，Sun KX，et al. Report of cancer incidence and mortality in China，2014[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2018，40（1）：5-13.

[2] Wang YB，Ba CF. Promoter methylation of esophageal cancer-related gene 4 in gastric cancer tissue and its clinical significance[J]. Hepatogastroenterology，2012，59（118）： 1696-1698.

[3] Yao D，Shi J，Shi B，et al. Quantitative assessment of gene methylation and their impact on clinical outcome in gastric cancer[J]. Clin Chim Acta，2012，413（7-8）：787-794.

[4] Feng L，Xie X，Ding Q，et al. Spatial regulation of raf kinase signaling by RKTG[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007， 104（36）：14348-14353.

[5] Cano E，Mahadevan LC. Parallel signal processing among mammalian MAPKs[J]. Trends Biochem Sci，1995，20（3）：117-122.

[6] Ling ZQ，Guo W，Lu XX，et al. A Golgi-specific protein PAQR3 is closely associated with the progression，metastasis and prognosis of human gastric cancers[J]. Ann Oncol，2014，25（7）：1363-1372.

[7] Chen J，Wang F，Xu J，et al. The role of PAQR3 gene promoter hypermethylation in breast cancer and prognosis[J]. Oncol Rep，2016，36（3）： 1612-1618.

[8] 曾子奕，徐海帆. DNA甲基化與腫瘤的相關(guān)研究[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31（7）：1007-1009.

[9] 高福利，呂瑛，朱銀鑫，等. DNA甲基化和組蛋白修飾的關(guān)鍵酶在胃癌中存在相互作用[J]. 中華消化雜志，2013，33（2）：106-110.

[10] 高燕，張厚德，林菊生. 人肝癌組織父系表達(dá)基因10印記狀態(tài)與差異性DNA甲基化區(qū)甲基化狀態(tài)的關(guān)系[J]. 中華消化雜志，2013，33（4）：279-280.

[11] 許麗霞，曾志榮，于君. 腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在胃癌中的功能意義及臨床價(jià)值[J]. 中華消化雜志，2011，31（4）：286-288.

[12] La Vecchia C. Ovarian cancer：Epidemiology and risk factors[J]. Eur J Cancer Prev，2017，26（1）：55-62.

[13] Kotsopoulos J，Rosen B，F(xiàn)an I，et al. Ten-year survival after epithelial ovarian cancer is not associated with BRCA mutation status[J]. Gynecol Oncol，2016，140（1）：42-47.

[14] Li RH，Zhang AM，Li S，et al. PAQR3 gene expression and its methylation level in colorectal cancer tissues[J]. Oncol Lett，2016，12（3）：1773-1778.

[15] Yu L，Zhou L，Cheng Y，et al. MicroRNA-543 acts as an oncogene by targeting PAQR3 in hepatocellular carcinoma[J]. Am J Cancer Res，2014，4（6）：897-906.

[16] 梁曉輝，孫保存，韓繼媛，等. PAQR3在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中國(guó)肺癌雜志，2017，20（4）：259-263.

[17] Fan F，F(xiàn)eng L，He J， et al. RKTG sequesters B-Raf to the Golgi apparatus and inhibits the proliferation and tumorigenicity of human malignant melanoma cells[J]. Carcinogenesis，2008，29（6）： 1157-1163.

[18] Guo W，You X，Xu D，et al. PAQR3 enhances Twist1 degradation to suppress epithelial-mesenchymal transition and metastasis of gastric cancer cells[J]. Carcinogenesis，2016，37（4）：397-407.

[19] Qiao S，Guo W，Liao L，et al. DDB2 is involved in ubiquitination and degradation of PAQR3 and regulates tumorigenesis of gastric cancer cells[J]. Biochem J，2015， 469（3）：469-480.

[20] Lounglaithong K，Bychkov A，Sampatanukul P. Aberrant promoter methylation of the PAQR3 gene is associated with prostate cancer[J]. Pathol Res Pract，2018，214（1）： 126-129.

（收稿日期：2018-01-21）