基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的當(dāng)歸補血湯治療貧血的作用機制研究

李 楊，郝俊杰

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137）

當(dāng)歸補血湯出自金元四大家之一李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》，2015版《中國藥典》收載了其成藥當(dāng)歸補血口服液〔1〕，由黃芪、當(dāng)歸二味中藥組成，具有補氣生血的功效，為補氣生血之基礎(chǔ)方。方中重用黃芪大補脾肺之氣，以資化源，使氣旺血生。配以當(dāng)歸養(yǎng)血和營，主治勞倦內(nèi)傷、氣弱血虛、陽浮外越所致的各種病癥。臨床上當(dāng)歸補血湯可用來治療和改善各種貧血，如腎性貧血、癌性貧血、營養(yǎng)性貧血等〔2-5〕。已有文獻從當(dāng)歸補血湯在促進骨髓造血系統(tǒng)重建、對傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)等方面對其在血液疾病中發(fā)揮效用進行了綜述〔6〕，但由于中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，通過多成分、多途徑、多靶點、協(xié)同作用來發(fā)揮藥效，因此當(dāng)歸補血湯治療貧血的綜合機制仍有待進一步闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過分析基因∕蛋白、疾病、藥物等數(shù)據(jù)庫與實驗室獲得的真實數(shù)據(jù)，融合系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，從系統(tǒng)、整體的角度構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)，去探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性〔7-8〕。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過預(yù)測多成分、多途徑、多靶點、協(xié)同作用的中藥復(fù)方及配伍作用機制具有天然的優(yōu)勢。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法構(gòu)建當(dāng)歸補血湯的“疾病-基因-藥物”網(wǎng)絡(luò)，對黃芪與當(dāng)歸配伍治療貧血的作用機制進行不同層面分析，以期為研究其作用機制及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)的建立 通過中藥臺灣數(shù)據(jù)庫（TDT，http:∕∕tcm.cmu.edu.tw∕）和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺 TCMSP（http:∕∕lsp.nwu.edu.cn∕tcmsp.php）獲得黃芪和當(dāng)歸所含的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，再依據(jù)相似性比較通過中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（HIT，http:∕∕lifecenter.sgst.cn∕hit∕）和治療靶點數(shù)據(jù)庫（TTD，http:∕∕bidd.nus.edu.sg∕group∕cjttd∕）篩選靶點，建立黃芪和當(dāng)歸靶點數(shù)據(jù)集。通過人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM，http:∕∕www.omim.org∕）篩選其治療貧血的基因和蛋白靶點，建立貧血靶點數(shù)據(jù)集。人類的靶點連接蛋白通過交互蛋白數(shù)據(jù)庫（http:∕∕dip.doe-mbi.ucla.edu）獲得。為了便于統(tǒng)一分析，以上所有靶點均轉(zhuǎn)化成UniProt ID（蛋白編號ID）格式〔9〕。

1.2 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了更合理地闡明當(dāng)歸補血湯中化學(xué)成分與貧血靶點之間的關(guān)系，我們對其進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。通過 PPI（http:∕∕www.genome.jp∕kegg∕）分析，將當(dāng)歸補血湯中黃芪和當(dāng)歸的化學(xué)成分、成分對應(yīng)的靶點、貧血對應(yīng)的靶點和交互蛋白對應(yīng)的靶點連接成“化學(xué)成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.6.1軟件將以上網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，每個點的度、接近中心度2個拓?fù)鋮?shù)通過CentiScaPe 1.2進行評估，篩選當(dāng)歸補血湯治療貧血的目的靶點。對篩選出的靶點使用STRING（https:∕∕string-db.org∕）進行蛋白互作關(guān)系分析，最后對篩選的靶點使用 DAVID（https:∕∕david.ncifcrf.gov∕）數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路分析和使用Cytoscape軟件的Blue GO插件進行GO功能分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物靶點和疾病靶點數(shù)據(jù)的篩選 基于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建方法，共篩選出黃芪中54個化學(xué)成分和283個靶點蛋白；當(dāng)歸中91個化學(xué)成分和110個靶點蛋白。

2.2 “藥物-靶點-疾病”之間交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測出當(dāng)歸補血湯治療貧血的交互網(wǎng)絡(luò)，采用不同的形狀圖形使其可視化后，讓我們更清晰直觀地看出化合物與疾病靶點之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。其中方形代表藥物與疾病共同作用的靶點，也是當(dāng)歸補血湯治療貧血的最重要的靶點蛋白；圓點代表藥物與疾病潛在的交互作用靶點；三角形代表當(dāng)歸補血湯中被預(yù)測出的活性化合物。見圖1。

圖1 當(dāng)歸補血湯治療貧血的“化學(xué)成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

2.3 當(dāng)歸補血湯治療貧血作用靶點的拓?fù)鋮?shù)分析通過對Cytoscape 3.6.1軟件整合的“化學(xué)成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)分析，得出當(dāng)歸補血湯活性成分關(guān)聯(lián)貧血的89個蛋白靶點。對這些蛋白靶點進行拓?fù)鋮?shù)計算。經(jīng)CentiScaPe對網(wǎng)絡(luò)中所有點的拓?fù)鋮?shù)（度、介度中心度和接近中心度）進行分析，得出3個拓?fù)鋮?shù)中位數(shù)分別為：4.000 00、0.001 98和0.225 28。在靶點中選擇度大于中位數(shù)值2倍，介度中心度、接近中心度大于中位數(shù)值的靶點共15個，作為當(dāng)歸補血湯治療貧血的重要靶點蛋白。見表1。篩選出的靶點蛋白互作關(guān)系見圖2，蛋白相互作用關(guān)系表明篩選出當(dāng)歸補血湯治療貧血的作用蛋白相互關(guān)聯(lián)和調(diào)節(jié)。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)在上述蛋白中當(dāng)歸補血湯中與一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible）作用的成分最多。見圖3和表2～3。

圖2 當(dāng)歸補血湯治療貧血的蛋白靶點互作關(guān)系圖

2.4 當(dāng)歸補血湯治療貧血的GO（基因功能）分析為了闡明當(dāng)歸補血湯治療貧血的生物學(xué)功能，對其進行了GO分析。發(fā)現(xiàn)主要為細(xì)胞周期阻滯調(diào)節(jié)（regulation of cell cycle arrest），G0到 G1的負(fù)調(diào)節(jié)（negative regulation of G0 to G1 transition）以及γ輻射響應(yīng)（response to gamma radiation）等。見圖4。

表1 當(dāng)歸補血湯治療貧血篩選的蛋白信息

表2 當(dāng)歸補血湯中當(dāng)歸作用于一氧化氮合酶的成分

表3 當(dāng)歸補血湯中黃芪作用于一氧化氮合酶的成分

圖3 當(dāng)歸補血湯中作用于一氧化氮合酶的成分

2.5 當(dāng)歸補血湯治療貧血的KEGG通路分析 對“2.3”項中篩選出的靶點在KEGG通路富集分析中，篩選出11條當(dāng)歸補血湯治療貧血的通路。主要包括細(xì)胞循環(huán)（Cell cycle）、P53信號通路（P53 signaling pathway）、甲狀腺激素信號通路（Thyroid hormone signaling pathway）、FoxO信號通路（FoxO signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1signalingpathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。見表4。

表4 當(dāng)歸補血湯治療貧血KEGG通路

3 討論

圖4 當(dāng)歸補血湯治療貧血GO（基因功能）分析

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析構(gòu)建了當(dāng)歸補血湯的“化學(xué)成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出當(dāng)歸補血湯治療貧血的15個共同作用的蛋白。在這些蛋白中，腫瘤壞死因子受體（Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A）〔10〕、糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid receptor）〔11〕、一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible）〔12〕、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase 4）和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白（G1∕S-specific cyclin-D1）〔13〕等都與貧血有關(guān)。通過其基因功能分析發(fā)現(xiàn)主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯調(diào)節(jié)（regulation of cell cycle arrest），G0到G1的負(fù)調(diào)節(jié)（negative regulation of G0 to G1 transition）等來治療貧血。據(jù)報道當(dāng)歸補血湯可以促進骨髓造血細(xì)胞從G0∕G1期進入G2∕M期和S期來改善骨髓抑制小鼠的造血機能，因此調(diào)節(jié)細(xì)胞周期可能是當(dāng)歸補血湯治療貧血的機制〔14〕。通路富集發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補血湯可以通過調(diào)節(jié)11條通路來治療貧血，其中細(xì)胞循環(huán)、P53信號通路、FoxO信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等均有報道在貧血中發(fā)揮著重要的作用〔15-18〕。本文從復(fù)方作用綜合揭示了當(dāng)歸補血湯中黃芪和當(dāng)歸配伍在治療貧血方面的多維調(diào)控作用，為尋找其有效成分和作用機制及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。