麻黃-甘草藥對治療水腫機制研究

郝俊杰，李 楊

（成都中醫藥大學藥學院，成都 611137）

甘草麻黃湯出自張仲景《金匱要略》，由甘草和麻黃兩味藥組成，主治“里水，一身面目黃腫”。麻黃和甘草配伍具有利水消腫的功效，在麻黃湯、葛根湯、越婢湯、麻杏石甘湯等中醫名方中廣泛使用。麻黃-甘草在臨床使用過程中逐漸形成常用的相對固定的配伍形式，即“藥對”〔1-3〕。麻黃-甘草藥對對水腫的治療作用及其相關的利尿作用已有文獻報道，但其藥效成分和療效機制尚待進一步研究。

中藥治療疾病是多成分、多途徑、多靶點、協同作用的結果，采用系統生物學等技術方法可以全面、準確把握中藥治療疾病的整體特征。2007年Hopkins等提出了“網絡藥理學”的概念，通過分析藥物對疾病網絡的干預，構建“藥物-靶點-疾病”的作用網絡，為藥物研發及中藥作用分析提供了新的策略〔4-5〕。網絡藥理學來預測中藥配伍作用機制具有天然的優勢，近年來利用網絡藥理學技術對中藥及其配伍的作用機制進行了大量的預測研究〔6-7〕。因此，本研究運用網絡藥理學研究方法構建麻黃-甘草藥對治療水腫的“疾病-基因-藥物”網絡，并預測其分子機制，揭示其治療水腫的作用靶點和生物學信號通路，為后續的分子生物學驗證找到切入點，為藥物開發和臨床拓展應用提供依據。

1 方法

1.1 藥物靶蛋白和疾病基因的查找 通過中藥臺灣數據庫（TDT，http：∕∕tcm.cmu.edu.tw∕）和中藥系統藥理學分析平臺TCMSP（http：∕∕lsp.nwu.edu.cn∕tcmsp.php）獲得麻黃和甘草所含的化學成分和靶點信息。通過人類基因和基因表型綜合數據庫（OMIM，http：∕∕www.omim.org∕）篩選水腫相關的基因，使用Uniprot（https：∕∕www.uniprot.org∕）數據庫轉化為蛋白格式，建立水腫靶點數據集。人類的靶點連接蛋白通過交互蛋白數據庫（http：∕∕dip.doe-mbi.ucla.edu）獲得。為了便于統一分析，以上所有靶點均轉化成UniProt ID（蛋白編號ID）格式〔8〕。

1.2 網絡的構建及分析 先通過PPI（http：∕∕www.genome.jp∕kegg∕）分析，尋找麻黃和甘草的化學成分對應靶點和水腫的疾病靶點的交互蛋白。然后利用Cytoscape 3.6.1軟件將麻黃和甘草的化學成分、成分對應的靶點、水腫對應的靶點和交互蛋白對應的靶點連接成“化學成分-靶點-疾病”網絡并進行網絡分析。將以上網絡進行可視化分析，并將每個點的度、接近中心度等拓撲參數進行評估，篩選麻黃-甘草藥對治療水腫的目的靶點。

1.3 網絡的構建 對“1.2”項篩選出的靶點使用STRING（https：∕∕string-db.org∕）進行蛋白互作關系分析，最后對篩選的靶點使用DAVID（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）數據庫進行KEGG通路分析和使用Cytoscape軟件的Blue GO插件進行基因功能分析。

2 結果

2.1 “藥物-靶點-疾病”之間交互網絡的構建 基于數據庫構建方法，共篩選出麻黃中223個化學成分和370個靶點蛋白；甘草中27個化學成分和135個靶點蛋白。網絡藥理學預測出麻黃-甘草藥對治療水腫的交互網絡，采用不同的形狀圖形使其可視化后，讓我們更清晰直觀地看出化合物與疾病靶點之間的網絡關系。其中方形代表藥物與疾病共同作用的靶點，也是麻黃-甘草藥對治療水腫最重要的靶點蛋白；圓點代表藥物與疾病潛在的交互作用靶點；三角形代表麻黃-甘草藥對中被預測出的活性化合物。見圖1。

圖1 麻黃-甘草藥對治療水腫的“化學成分-靶點-疾病”交互網絡

2.2 麻黃-甘草藥對治療水腫作用篩選和相互作用分析 通過對Cytoscape交互網絡分析，得出在麻黃-甘草藥對活性成分關聯水腫的40個蛋白靶點。對這些蛋白靶點進行拓撲參數計算。選擇度大于中位數值2倍，介度中心度和接近中心度大于中位數值的靶點共同作為麻黃-甘草藥對治療水腫的重要靶點蛋白，3個拓撲參數中位數分別為：4.000 00、0.002 87和0.268 03。通過篩選得到10個麻黃-甘草藥對治療水腫的靶點。見表1。篩選出的靶點的蛋白互作關系見圖2，蛋白相互作用關系表明篩選出麻黃-甘草藥對治療水腫的作用蛋白是相互關聯和彼此調節的。把麻黃-甘草藥對治療水腫的靶點相關的化學成分進行提取。見圖3和表2～3。

圖2 麻黃-甘草藥對治療水腫的蛋白靶點互作關系圖

圖3 麻黃-甘草藥對治療水腫的靶點和相關的化學成分

表1 麻黃-甘草藥對治療水腫篩選的靶點蛋白信息

表2 甘草治療水腫的靶點的相關化學成分信息

2.3 麻黃-甘草藥對治療水腫的GO功能（基因功能）分析 通過基因分析發現麻黃-甘草藥對治療水腫主要通過以下的生物學功能：血管內皮細胞遷移的調控（regulation of blood vessel endothelial cell migration）和單核細胞分化（monocyte differentiation）。見圖4。

2.4 麻黃-甘草藥對治療水腫的KEGG通路分析對“2.2”項中篩選出的靶點在KEGG通路富集分析中，篩選出15條麻黃-甘草藥對治療水腫的通路。主要包括血管內皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）、B細胞受體信號通路（B cell receptor signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、T細胞受體信號通路（B cell receptor signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、神經營養素信號通路（Neurotrophin signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）等。見表4。

表3 麻黃治療水腫的靶點的相關化學成分信息

表4 麻黃-甘草藥對治療水腫KEGG通路信息

3 討論

本研究通過網絡藥理學分析構建了麻黃-甘草藥對的“化學成分-靶點-疾病”交互網絡圖，篩選出麻黃-甘草藥對治療水腫的靶點蛋白并進一步分析其機制。在篩選出的蛋白中，核轉錄因子（Inhibitor of nuclear factor）〔9〕、血管內皮生長因子（Vascularendothelial growth）〔10〕、血清白蛋白（Serum albumin）〔11〕、過氧化物酶體增生物激活受體γ（proliferator-activated receptor gamma）〔12〕和前列腺素（Prostaglandin G∕H synthase 2）〔13〕都與水腫密切相關。通過分析發現血管內皮生長因子信號通路和基因功能分析得到的血管內皮細胞遷移的調控在麻黃-甘草藥對治療水腫中發揮著極其重要的作用。血管內皮生長因子調控內皮細胞遷移行為〔14〕，據報道血管內皮生長因子可通過影響內皮緊密結合蛋白的功能增加血管通透性，造成毛細血管滲漏，抗血管內皮生長因子藥物可以治療水腫〔15〕，因此麻黃-甘草藥對可通過調節血管內皮生長因子信號通路來治療水腫。其他信號通路如PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）等均有報道在水腫中發揮了重要作用〔16-19〕。綜上所述，采用網絡藥理學方法探索麻黃-甘草藥對治療水腫的作用機制，能夠找到與療效相關的生物信號通路。為下一步麻黃-甘草藥對治療水腫的分子生物學驗證奠定了基礎，本研究揭示了麻黃-甘草藥對在治療水腫方面的多維調控作用，為藥物開發及臨床應用奠定基礎。