急性心肌梗死通過氧化應激及NF-kb途徑加重造影劑腎損害機制研究

陶志文

（南京醫科大學第一附屬醫院心內科 江蘇 南京 210029）

造影劑腎病是院內獲得性腎功能不全的第三位因素，其定義為應用造影劑后48～72小時肌酐升高較基線水平大于25%或者絕對值增加0.5mg/dL(44.2μmol/L)。有研究調查表明在廣泛應用造影劑的人群中，造影劑腎病的發生率在約2%。然而在高危人群中造影劑腎病的發生率約在20%～30%［1-5］。已有充分數據表明急性心肌梗死PCI導致的造影劑腎病的發生率顯著高于擇期PCI手術患者［6-7］。既往有研究揭示了造影腎病的發生是由于急性腎損傷，根據以往研究和調查，造影劑腎病的發生機制包括了以下方面，（1）腎循環改變導致的缺血缺氧，（2）造影劑的直接腎毒性和氧化應激，（3）急性心肌梗死這種特殊病理生理狀態[8-11]。目前急性心肌梗死狀態造影劑對腎臟的損害的病理過程仍不清楚。因此，本研究的目的是進一步明確造影劑腎病在急性心肌梗死狀態發生率升高的機制。

1.研究方法

1.1 心肌梗死模型建立和實驗分組

大鼠過夜禁水大約12小時，通過結扎大鼠前降支構建心肌梗死模型，并最后行心臟超聲檢查確定心肌梗死模型建立成功。未結扎前降支的大鼠分為對照組control（n=8）和造影劑組CM（n=12）,結扎前降支的大鼠，分為心肌梗死組AMI（n=8），心肌梗死+造影劑AMI+CM(n=12)。CM組和AMI+CM 組注射造影劑，劑量為2g 碘/kg，Control組和AMI組注射等劑量生理鹽水。

1.2 血流動力學監測

各組術后45min，大鼠行心臟超聲檢查，檢查心臟室壁運動功能及左室射血分數，CM組和AMI+CM組在基線水平檢測各組右側腎動脈血流速度，然后分別注射造影劑記錄各組在0min,2min,8min,15min,4h,24h的腎血流速度的數值（VRABF）。

1.3 造影劑滯留觀察

在CM組和AMI+CM組，隨機取四只進行腎CT掃描，記錄注射造影劑前基線水平，注射造影劑后4h和12h，觀察造影劑在腎臟內存留情況，并計算腎皮質的CT掃描得出的對比度值。

1.4 血清學指標檢測

在各組處死后行下腔靜脈抽血，然后分別測各個指標。血肌酐采取 Jaffe反應比色法測定。血清ET-1和Ang-Ⅱ采取按照試劑廠商說明書進行檢測。

1.5 腎臟組織活性氧族檢測

各組處死后取右側腎臟，按照杰美公司的試劑盒說明進行操作。即刻放進熒光酶標儀檢測：激發波長490nm，散發波長520nm。最終得出各組的熒光讀數，最后以control組作為基線對照。每組腎臟組織各取100mg，進行提取RNA，方法如下：勻漿處理：將組織在液氮中磨碎,每100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。然后進行cDNA的合成，引物設計通過Primer 5軟件設計引物 NF-ΚB p53mRNA為 5-CCAAAGACCCACCTCACC-3(forward)and 5-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3(reverse),Caspase-3的引物為5-GCTGAGTATGTCGTGGAG-3(forward) 和5-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3(reverse).GAPDH 的引物為 was 5- CTGGACTGCGGTATTGAG-3(forward)and5- GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3(reverse)。逆轉錄合成通過反轉錄試劑盒操作，應用反轉錄PCR儀合成cDNA，然后在通過Real-time PCR 擴增，擴增結束后，得到每孔的CT，最后通過GAPDH作為內參，先每組都減去GAPDH CT，然后在減去所有組中的最大值及計算應用2-??Ct。

1.6 統計學處理

采用SPSS進行t檢驗和單因素方差分析比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 腎功能、內皮素、血管緊張素、腎臟ROS表達水平在各組的變化

內皮素在4h節點CMI、CMI+AMI、AMI均有顯著升高，并且CM、CM+AMI在24h仍然顯著高于對照組(P＜0.05)。AMI+CM組的4h內皮素表達顯著高于CM組（P＜0.05)。(Fig1A) 血管緊張素在4h節點CMI、CMI+AMI、AMI均有顯著升高。AMI+CM血管緊張素在4h表達最高（P＜0.05）。隨后AMI+CM組血管緊張素表達在24h已下降。(Fig 1B)肌酐在4h時所有組均無顯著改變(P＞0.05)。除了對照組，其他組在24h時肌酐均顯著升高，其中AMI+CM組是肌酐升高最顯著的（P＜0.05），CM組肌酐水平和AMI組比較無顯著差異。(Fig 1C)與對照組比較，AMI、AMI+CM、CM組在4h時ROS表達顯著增高，并且持續升高至24h。AMI+CM組的ROS表達水平在24h顯著高于其他組(P＜0.05)。(Fig 1D)

2.2 腎動脈血流速度在各組的變化

AMI+CM組的腎動脈血流速度從0min～24小時均顯著低CM組(P＜0.05)。在剛開始注射造影劑的2min內，腎動脈血流速度在CM組從1042.7±92.6mm/s 增加至1290±107.80 mm/s。AMI+CM組從792.80±36.19 mm/s 增加至 1043.39±75.58 mm/s。隨后腎動脈血流速度下降至基線水平至24h(Fig 2A)。在注射造影劑前，通過超聲心動圖評估各組的的室壁運動障礙。可以發現建立心肌梗死模型的大鼠的室壁運動顯著減弱，心臟超聲檢測LVEF，AMI+CM組和AMI組的LVEF顯著下降，和CM組和對照組比較顯著差異（P＜0.05），AMI和AMI+CM之間無顯著差異，CM和對照組無顯著差異（P＞0.05）。(Fig 2B 2C)

2.3 造影劑在腎臟滯留各組比較

總體上造影劑注射后各組均有一定程度的造影劑的滯留。在CM組和AMI+CM組造影劑注射4h后，我們觀察到腎皮質CT分別為124.85±15.37 and 65.06±7.13 HU，(兩組基線值分別為 46.48±2.9HU and 45.36±2.68 HU)。在造影劑注射12h后，AMI+CM和CM組的CT和基線比較無顯著差異。(FIG.3)

2.4 NF-κb and caspase-3 mRNA在各組表達情況

NF-kb因子表達升高與腎臟損傷有密切關聯，故我們通過real-time PCR方法檢測各組腎臟中NF-kb表達情況.結果顯示與對照組相比，其余各組NF-kb.的表達均有顯著升高，4h時CM組，CM+AMI組基因表達顯著高于control組，并且仍然在24h持續。AMI組在24h也有所升高，但顯著低于CM+AMI組的表達（P＜0.05），CM+AMI組表達在24h也顯著高于CM組（P＜0.05）。(Fig4A)Caspase-3基因與凋亡和腎臟損害有一定關系。Caspase-3基因表達與control組相比，CM組，AMI+CM組和AMI組在4h也顯著升高。CM組和CM+AMI組仍然繼續升高至24h，而AMI組在24h則下降。在CM+AMI組，該基因的表達在4h和24h顯著顯高于CM組(P＜0.05)。(Fig 4B).

3.討論

本研究表明在急性心肌梗死狀態下，造影劑對腎臟的損害要比正常狀態下的大鼠更加嚴重。主要為心梗導致的血流動力學變化，以及造影劑和心梗帶來的氧化應激，從而引起的凋亡和氧化應激相關基因水平的改變。

（1）血流動力學改變。造影劑可以引起腎動脈及腎內血流動力學改變已經被很多動物實驗和臨床實驗所證實，這主要表現在腎皮質和髓質的血流下降[12-13]，和增加的腎內血管的阻力。我們通過結扎前降支建立心肌梗死模型，并且是引起急性癥狀和血流動力學改變較大的常見血管，所有大鼠在注射造影劑前檢測VRABF，開始進行造影劑注射，結果表明造影劑對腎動脈的影響在CM和CM+AMI組兩者是無顯著影響的，所以我們認為心肌梗死引起了腎動脈的血流下降，進一步引起了腎內灌注不足，從本研究中發現ET-1在AMI+CM組一直都是處于最高，從4h開始到24h仍然繼續升高。Ang-Ⅱ也是縮血管物質，但主要作用于較大血管及動脈血管，本實驗中Ang-Ⅱ在AMI+CM組升高最顯著，也有文獻報道正常大鼠在注射造影劑后Ang-Ⅱ會有所升高[11，14]。通過CT掃描觀察造影劑在AMI+CM組和CM組腎臟的滯留，結果說明造影劑在AMI+CM組滯留的時間更長，這也與腎血流的下降和縮血管物質的增多引起的微循環功能的障礙相互吻合。

（2）氧化應激，NF-κb和CASPASE-3 基因升高。以往很多研究表明造影劑引起的腎臟損害，特別是腎小管的凋亡和氧化應激密切相關，在一些大規模的臨床試驗中，抗氧化劑NAC被證明可以減少臨床造影劑腎病的發生[15]，本試驗中同樣發現ROS產生最多的也是AMI+CM組，而AMI組高于control組說明心肌梗死時本身就造成了腎臟ROS的增多，并且和CM組升高無顯著差異，可以認為在心肌梗死后在注射造影劑前ROS就已經升高，已經改變了髓質的氧平衡，從而增強了ROS這種途徑的損傷作用。ROS在凋亡中扮演了重要角色，許多實驗表明ROS和凋亡密切相關，最后激活了Caspase-3[16]。Caspase-3是調節凋亡的最重要一個基因，許多實驗都已經證實在注射造影劑后該基因會升高[17-19]，我們實驗同樣也證實其重要性，實驗結果說明了在心肌梗死時Caspase-3腎臟表達升高并且和造影劑造成該基因表達上調相互增強是促進凋亡的一個重要因素。NF-κb是一個重要的核轉錄因子，有多重效應，有文獻報道它與細胞凋亡有相關，可以促進細胞凋亡[20-21]而有研究表明氧化應激可以激活其表達，并且和造影劑對腎臟的損害有相關[22]。本實驗中發現了該基因表達的增高，并且在AMI+CM組增高最顯著，在AMI組我們也發現了該基因表達增高，同樣也說明了在心肌梗死時腎臟的ROS有所升高。在很多指標如ET-1，Ang-Ⅱ，Caspast-3等在AMI組表達和在CM組相似，但這些改變在AMI組只造成了較少的凋亡比例，和輕微的腎臟病理學的改變，這些病理生理改變與CM組相比顯著減輕，這些結果表明造影劑對腎小管的損害作用是最主導的作用，心肌梗死狀態只是對造影劑作用起到一定強化。