時間和密度對公豬精子活力和運動參數的影響

郭 蘋， 陳永霞， 馬 靜， 楊劍波， 邢 軍， 吳井生

(1.江蘇農林職業技術學院，江蘇句容 212400； 2.江蘇省句容市畜牧獸醫總站，江蘇句容 212400；3.江蘇省句容市動物疫病預防控制中心，江蘇句容 212400)

精液品質檢查是評價公豬種用價值最基本也是最重要的檢查方法，檢查結果能直接或間接反映公豬的生殖機能狀況、利用年限、飼養管理水平、母豬受胎率等情況，因此精液品質檢查是豬人工授精技術過程中的一個重要環節，也是保證母豬受胎率的一個重要技術手段，能直接影響到后代的數量、質量和豬場的經濟效益[1]。

豬的精液品質檢查指標主要包括精液量、密度、活力、pH值等，采用的方法主要是肉眼估測、人工計數等，存在檢測時間長、準確性不高、檢測指標少等問題[2]。人類的精液品質檢查發展迅速，技術成熟，方法可行，設備先進。本試驗參照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第五版)[3]，將精子活動力分為前向運動(PR)、非前向運動(NP)和不活動(IM)3個類別，精子活力一般用前向運動的精子百分率表示，精子活動率則用前向運動和非前向運動的精子(PR+NP)百分率來表示。

本試驗采用計算機輔助精子分析(CASA)系統進行檢測，檢測精子運動參數，分析采精后不同時間節點以及不同密度對精子活力、精子活動率、精子運動速度等指標的影響，以期為精液品質檢查時間節點和精液稀釋時間間隔等研究提供理論依據，同時也為后續的精液處理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用種公豬均來自江蘇農林職業技術學院種豬場，其中：長白豬(L)3頭、大白豬(Y)3頭、杜洛克豬(D)4頭、巴克夏豬(B)2頭、梅山豬(M)6頭，均為成年種公豬(28～38月齡)。每頭種公豬每周采精2次，固定采精時間和采精員。試驗時間為2016年11月至2017年7月，試驗地點為江蘇農林職業技術學院種豬場實驗室。

1.2 精液采集和指標測定

公豬精液的采集用手握法進行；在采精過程中，棄去前后段精清，收集中段富含精子部分，用4層滅菌紗布過濾精液，采完精后，立即吸取10 μL精液，放入2 μL觀察池(標準計數板，8個觀察池。每個觀察池22 μL，池高20 μm)，置于負相差顯微鏡下觀察和檢測。

采用西班牙CASA系統進行精液質量分析。測定的主要指標：精子活力指標有PR、NP；精子運動速度指標有曲線速率(VCL)、直線速率(VSL)和平均軌道速率(VAP)；精子運動方式指標有線性(LIN)、直向(STR)、擺動(WOB)、頭側擺振幅(ALH)、交打頻率(BCF)。檢測時，要求精子總數不低于500個。

1.3 分組方式和數據統計

1.3.1 分組方式 時間分組按照精液采集后0、10、20、30、60 min進行，采集的精液放入37 ℃恒溫箱中，一直放到檢測完畢；密度按照1.0億個/mL及以下、1.0億～1.5億個/mL、1.5億～2.0億個/mL、2.0億個/mL 以上進行分組，分別記作D1、D2、D3、D4組。

1.3.2 數據統計 采用SPSS 19.0軟件中GLM程序對各項數據進行方差分析，差異顯著或極顯著時采用LSD法進行多重比較，結果表示為邊際均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 時間和密度對精子活力和活動率的影響

在不同時間下，精子平均活力變化情況見表1。前向運動精子比例和精子活動率在采精后即檢測時最高，分別為(50.29±2.22)%、(92.29±2.49)%，隨后，精子活力下降。10 min后，精子活力和精子活動率分別為(44.70±2.17)%、(86.87±2.43)%，與采精時相比差異不顯著(P>0.05)。20 min 后，與0 min時差異達到極顯著水平(P<0.01)。與0 min 相比，60 min時的精子活力、活動率降幅分別為29.91%、16.48%。非前向運動精子比例在0～60 min之間變化不明顯，差異不顯著(P>0.05)。在0～60 min之間，PR和 PR+NP的變化呈現下降趨勢，NP變化趨于平穩，變化幅度不大。

表1 不同時間下精子平均活力和活動率檢測結果

注：同行數據后標有不同大寫字母、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。下表(除表8)同。

在比較不同時間下精子平均活力變化情況的基礎上，分析了不同原精密度下PR和PR+NP比例變化趨勢。由表2可知，在不同原精密度下，PR比例隨時間變化大體上均表現為下降趨勢，60 min時與采精時相比，D1組下降幅度最大，為23.15百分點，D4組下降幅度最小，為4.34百分點；D1組中，采精后0 min與10 min時精子活力相比，差異不顯著(P>0.05)，但與20、30、60 min時相比，差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；D4組中，采精后0 min時的PR比例在所有密度組別中最高，為(56.68±3.36)%，60 min后的比例為(52.34±3.36)%。

表2 不同原精密度下PR比例變化結果

由表3可知，精子的活動率在不同密度組別中大體上均隨時間表現為下降趨勢，其中，D1組別的下降幅度最大，D4組別下降幅度最小，D2和D4組別中，各時間點精子總的活力檢測結果差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同原精密度下PR+NP比例變化結果

2.2 時間和密度對精子運動速度的影響

由表4可知，VCL、VSL、VAP等精子運動速度指標均隨時間呈現下降現象。在VCL方面，采精0 min時最大，為(50.52±1.73) μm/s，10 min后降至(45.65±1.68) μm/s，但兩者間差異不顯著(P>0.05)，之后繼續下降，20 min后降至(43.93±1.73) μm/s，與采精0 min時差異達到極顯著水平(P<0.01)，60 min后降至(38.85±1.68) μm/s，降幅達 23.10%。在VSL方面，采精0 min時最大，為(16.46±0.60) μm/s，與10 min時相比差異不顯著(P>0.05)，與采精 20 min 時相比，差異顯著(P<0.05)，與30、60 min時相比，差異極顯著(P<0.01)。在VAP方面，采精0 min時最大，為(27.80±0.95) μm/s，10 min后降至(25.74±0.92) μm/s，差異不顯著(P>0.05)，與20、30 min時相比，差異顯著(P<0.05)，與60 min時相比，差異極顯著(P<0.01)。

表4 不同時間下精子運動速度檢測結果

根據不同時間下精子運動速度和顯著性檢驗結果分析了不同精子密度下VCL、VSL、VAP的時間變化規律，具體結果見表5、表6、表7。

由表5可知，就VCL而言，總的趨勢是，無論在哪種密度下，VCL隨時間的延長而降低，只是降低幅度不同而已；D2組在各時間節點的平均VCL差異不顯著(P>0.05)；D4組在60 min時的平均VCL高于其他密度級別不同時間節點的水平。

表5 不同原精密度不同時間精子VCL檢測結果

由表6可知，就VSL而言，也呈現隨時間增加而降低的現象，D4密度級別平均VSL普遍高于其他密度級別同一時間節點的水平；D2組各時間節點的平均VSL差異不顯著(P>0.05)；D1組中，采精后0 min時檢測的平均VSL水平高于 60 min 時的水平，兩者間差異達到極顯著水平(P<0.01)；D3組中，0 min時的水平顯著高于60 min時的水平(P<0.05)，但兩者與其他各時間節點的差異均不顯著(P>0.05)。

表6 不同原精密度不同時間節點下精子VSL檢測結果

由表7可知，就VAP而言，D1組中，0 min時的平均VAP水平極顯著高于60 min時的水平(P<0.01)；D2組中，各時間節點間差異不顯著(P>0.05)；D3組中，0 min時的水平顯著高于60 min時的水平(P<0.05)，但兩者與其他時間節點水平間差異不顯著(P>0.05)；D4組中，0 min時的水平最高，為(43.39±3.70) μm/s，顯著高于60 min時的(31.07 ±3.70) μm/s(P<0.05)。

表7 不同原精密度不同時間節點下精子VAP檢測結果

2.3 時間和密度對精子運動方式的影響

由表8可知，在LIN、STR、WOB、ALH和BCF中，LIN、STR和WOB變化較平緩，上下波動幅度較小；ALH在各時間節點都表現出下降的趨勢，但不明顯，0～60 min間下降 0.184 μm，降幅為6.73%，差異不顯著(P>0.05)；在BCF中，0 min 時檢測水平最高，為(6.059±0.197) Hz，之后呈現明顯下降趨勢，至60 min時下降了1.201 Hz，降幅為19.82%，差異極顯著(P<0.01)，0 min時與20、30 min時比較，差異極顯著(P<0.01)。

表8 不同時間下精子其他運動參數檢測結果

注：同列數據后不同大、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。

由表9可知，在不同原精密度不同時間節點下精子BCF檢測結果總體呈現下降趨勢，D2和D4組中各時間節點水平間差異不顯著(P>0.05)，采精后60 min時與采精時相比降幅分別為9.53%、13.38%，D1和D3組的下降幅度分別為28.72%、20.89%，與0 min間的差異均達到極顯著水平(P<0.01)。

3 討論

本試驗采用CASA系統檢測豬精子運動參數，該系統在人類精液檢測中已被廣泛使用，相對于常規精液分析而言，具有客觀性強、準確性高、重復性好等優點，適合用于臨床精液標本的檢測[4-5]，一般30 s內就能完成1個樣本的檢測。

表9 不同原精密度不同時間節點下精子BCF檢測結果

精液標本從采集到分析的時間間隔是影響精液檢測結果準確性的重要因素，也是檢測前質量控制的重要環節[6]。在人類精液檢測上，為確保檢驗結果的準確性，提供更有價值的參考數據給臨床，讓各實驗室之間的檢驗結果更具可比性，精液標本從采集到分析的時間間隔應嚴格控制[7-9]，推薦的時間間隔為30 min。根據GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產與保存技術規范》中的規定，精液采集后應盡快稀釋，放置時間不超過15 min。

關于檢測時間對精液品質影響的報道，張將等研究認為，精子濃度和圓細胞濃度在精液液化后15、30、45、60、90、120 min 較穩定，精子活力及活動率在30 min內也較穩定，30 min 后精子活力顯著下降，45 min后精子活動力也顯著下降，精子活力及精子活動率均與檢測時間呈負相關[6]；邵永等研究表明，30、60、90 min檢測的精子活力及活動率均分別顯著低于20 min時檢測的活力及活動率[10]；潘鋒等研究顯示，15、30、60 min內精子活力及活動率顯著下降[11]；蒲江波等研究認為，人類精子最佳檢測時間為完全液化后的1 h，隨著時間的延長，精子的PR和PR+NP均明顯下降，下降的主要原因是精子能源供給不足[12]，精子活力下降不是呈直線式而是波浪式[12-14]。陳碧等研究了取精后至冷凍前的間隔時間對精子冷凍復蘇效果的影響，結果表明精液取出15、30 min后進行凍存的精子復蘇率顯著高于60 min的[15]。

本研究結果顯示，精子活力和精子活動率大體上均表現為隨時間延長而降低的趨勢，在20 min時均極顯著低于 0 min 的檢測水平，60 min時兩者的檢測水平降幅分別達29.91%、16.48%。在不同密度級別下，60 min后精子活力檢測結果降幅不一，D1組中達45.45%，D4組中僅為7.66%，60 min 后精子活動率檢測結果降幅亦不一，D1組中達 26.05%，D4組中為1.20%。結果表明，密度大的精液緩沖能力強，精子活力降幅小，密度小的精液緩沖能力弱，精子活力降幅大。

VCL、VSL和VAP是以精子頭部為參照物，測定其單位時間內精子頭部移動距離或相對位移，可以反映精子的運動能力，LIN、STR、WOB、ALH、BCF等指標可以用來反映精子運動方式，所以認為精液在體外放置時間延長不僅降低精子的運動能力，又可以影響其運動方式[10]。

邵永等研究了精液留取后不同時間對精子運動參數的影響，結果顯示，BCF在30 min時顯著高于20 min時，90 min時VCL顯著低于20、30 min時，30、60、90 min時的STR與 20 min 時相比顯著降低，90 min時的VAP、VSL分別顯著低于20 min時的[10]。

本研究中，VCL、VSL和VAP等精子運動速度指標整體均呈現隨精液離體時間延長而下降現象；在VCL方面，精液采集時(0 min)的VCL水平極顯著高于20、30、60 min時，在VSL方面，0 min的VSL水平顯著高于20 min時，極顯著高于精液采集后30、60 min時，在VAP方面，0 min時的VAP水平顯著高于20、30 min時，極顯著高于60 min時。在LIN、STR、WOB、ALH和BCF中，LIN、STR和WOB變化較平緩，上下波動幅度較小，在ALH中，各時間節點表現出下降的趨勢，但不明顯，差異不顯著(P>0.05)，在BCF中，0 min時檢測水平最高，為(6.059±0.197) Hz，之后呈現明顯下降趨勢，至60 min時下降1.201 Hz，降幅為19.82%，差異極顯著(P<0.01)，0 min 時與20、30 min時比較，差異極顯著(P<0.01)。

隨著時間的延長，精子細胞脫水，pH值發生改變，滲透壓的變化及溫度的變化均會造成精子活力、活動率、運動參數等降低，尤其是精漿果糖濃度的降低、絲氨酸蛋白酶活性的改變以及精子DNA的損傷等可能因素的影響，是造成精子活力、活動率和運動參數改變的重要因素[13-15]。

4 結論

本試驗中，精子活力(PR)、精子活動率(PR+NP)、VCL、VSL和VAP等精子運動速度指標均表現為隨時間延長而降低的趨勢，密度大的精液緩沖能力強，精子活力和運動參數降幅小，密度小的精液緩沖能力弱，精子活力和運動參數降幅大，精液品質檢查和精液稀釋等工作最好在采精后10 min內完成。