時間和密度對公豬精子活力和運(yùn)動參數(shù)的影響

郭 蘋， 陳永霞， 馬 靜， 楊劍波， 邢 軍， 吳井生

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400； 2.江蘇省句容市畜牧獸醫(yī)總站，江蘇句容 212400；3.江蘇省句容市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇句容 212400)

精液品質(zhì)檢查是評價公豬種用價值最基本也是最重要的檢查方法，檢查結(jié)果能直接或間接反映公豬的生殖機(jī)能狀況、利用年限、飼養(yǎng)管理水平、母豬受胎率等情況，因此精液品質(zhì)檢查是豬人工授精技術(shù)過程中的一個重要環(huán)節(jié)，也是保證母豬受胎率的一個重要技術(shù)手段，能直接影響到后代的數(shù)量、質(zhì)量和豬場的經(jīng)濟(jì)效益[1]。

豬的精液品質(zhì)檢查指標(biāo)主要包括精液量、密度、活力、pH值等，采用的方法主要是肉眼估測、人工計數(shù)等，存在檢測時間長、準(zhǔn)確性不高、檢測指標(biāo)少等問題[2]。人類的精液品質(zhì)檢查發(fā)展迅速，技術(shù)成熟，方法可行，設(shè)備先進(jìn)。本試驗參照《人類精液檢查與處理實(shí)驗室手冊》(第五版)[3]，將精子活動力分為前向運(yùn)動(PR)、非前向運(yùn)動(NP)和不活動(IM)3個類別，精子活力一般用前向運(yùn)動的精子百分率表示，精子活動率則用前向運(yùn)動和非前向運(yùn)動的精子(PR+NP)百分率來表示。

本試驗采用計算機(jī)輔助精子分析(CASA)系統(tǒng)進(jìn)行檢測，檢測精子運(yùn)動參數(shù)，分析采精后不同時間節(jié)點(diǎn)以及不同密度對精子活力、精子活動率、精子運(yùn)動速度等指標(biāo)的影響，以期為精液品質(zhì)檢查時間節(jié)點(diǎn)和精液稀釋時間間隔等研究提供理論依據(jù)，同時也為后續(xù)的精液處理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用種公豬均來自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院種豬場，其中：長白豬(L)3頭、大白豬(Y)3頭、杜洛克豬(D)4頭、巴克夏豬(B)2頭、梅山豬(M)6頭，均為成年種公豬(28～38月齡)。每頭種公豬每周采精2次，固定采精時間和采精員。試驗時間為2016年11月至2017年7月，試驗地點(diǎn)為江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院種豬場實(shí)驗室。

1.2 精液采集和指標(biāo)測定

公豬精液的采集用手握法進(jìn)行；在采精過程中，棄去前后段精清，收集中段富含精子部分，用4層滅菌紗布過濾精液，采完精后，立即吸取10 μL精液，放入2 μL觀察池(標(biāo)準(zhǔn)計數(shù)板，8個觀察池。每個觀察池22 μL，池高20 μm)，置于負(fù)相差顯微鏡下觀察和檢測。

采用西班牙CASA系統(tǒng)進(jìn)行精液質(zhì)量分析。測定的主要指標(biāo)：精子活力指標(biāo)有PR、NP；精子運(yùn)動速度指標(biāo)有曲線速率(VCL)、直線速率(VSL)和平均軌道速率(VAP)；精子運(yùn)動方式指標(biāo)有線性(LIN)、直向(STR)、擺動(WOB)、頭側(cè)擺振幅(ALH)、交打頻率(BCF)。檢測時，要求精子總數(shù)不低于500個。

1.3 分組方式和數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.3.1 分組方式 時間分組按照精液采集后0、10、20、30、60 min進(jìn)行，采集的精液放入37 ℃恒溫箱中，一直放到檢測完畢；密度按照1.0億個/mL及以下、1.0億～1.5億個/mL、1.5億～2.0億個/mL、2.0億個/mL 以上進(jìn)行分組，分別記作D1、D2、D3、D4組。

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 19.0軟件中GLM程序?qū)Ω黜棓?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著或極顯著時采用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為邊際均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 時間和密度對精子活力和活動率的影響

在不同時間下，精子平均活力變化情況見表1。前向運(yùn)動精子比例和精子活動率在采精后即檢測時最高，分別為(50.29±2.22)%、(92.29±2.49)%，隨后，精子活力下降。10 min后，精子活力和精子活動率分別為(44.70±2.17)%、(86.87±2.43)%，與采精時相比差異不顯著(P>0.05)。20 min 后，與0 min時差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。與0 min 相比，60 min時的精子活力、活動率降幅分別為29.91%、16.48%。非前向運(yùn)動精子比例在0～60 min之間變化不明顯，差異不顯著(P>0.05)。在0～60 min之間，PR和 PR+NP的變化呈現(xiàn)下降趨勢，NP變化趨于平穩(wěn)，變化幅度不大。

表1 不同時間下精子平均活力和活動率檢測結(jié)果

注：同行數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫字母、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。下表(除表8)同。

在比較不同時間下精子平均活力變化情況的基礎(chǔ)上，分析了不同原精密度下PR和PR+NP比例變化趨勢。由表2可知，在不同原精密度下，PR比例隨時間變化大體上均表現(xiàn)為下降趨勢，60 min時與采精時相比，D1組下降幅度最大，為23.15百分點(diǎn)，D4組下降幅度最小，為4.34百分點(diǎn)；D1組中，采精后0 min與10 min時精子活力相比，差異不顯著(P>0.05)，但與20、30、60 min時相比，差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；D4組中，采精后0 min時的PR比例在所有密度組別中最高，為(56.68±3.36)%，60 min后的比例為(52.34±3.36)%。

表2 不同原精密度下PR比例變化結(jié)果

由表3可知，精子的活動率在不同密度組別中大體上均隨時間表現(xiàn)為下降趨勢，其中，D1組別的下降幅度最大，D4組別下降幅度最小，D2和D4組別中，各時間點(diǎn)精子總的活力檢測結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同原精密度下PR+NP比例變化結(jié)果

2.2 時間和密度對精子運(yùn)動速度的影響

由表4可知，VCL、VSL、VAP等精子運(yùn)動速度指標(biāo)均隨時間呈現(xiàn)下降現(xiàn)象。在VCL方面，采精0 min時最大，為(50.52±1.73) μm/s，10 min后降至(45.65±1.68) μm/s，但兩者間差異不顯著(P>0.05)，之后繼續(xù)下降，20 min后降至(43.93±1.73) μm/s，與采精0 min時差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，60 min后降至(38.85±1.68) μm/s，降幅達(dá) 23.10%。在VSL方面，采精0 min時最大，為(16.46±0.60) μm/s，與10 min時相比差異不顯著(P>0.05)，與采精 20 min 時相比，差異顯著(P<0.05)，與30、60 min時相比，差異極顯著(P<0.01)。在VAP方面，采精0 min時最大，為(27.80±0.95) μm/s，10 min后降至(25.74±0.92) μm/s，差異不顯著(P>0.05)，與20、30 min時相比，差異顯著(P<0.05)，與60 min時相比，差異極顯著(P<0.01)。

表4 不同時間下精子運(yùn)動速度檢測結(jié)果

根據(jù)不同時間下精子運(yùn)動速度和顯著性檢驗結(jié)果分析了不同精子密度下VCL、VSL、VAP的時間變化規(guī)律，具體結(jié)果見表5、表6、表7。

由表5可知，就VCL而言，總的趨勢是，無論在哪種密度下，VCL隨時間的延長而降低，只是降低幅度不同而已；D2組在各時間節(jié)點(diǎn)的平均VCL差異不顯著(P>0.05)；D4組在60 min時的平均VCL高于其他密度級別不同時間節(jié)點(diǎn)的水平。

表5 不同原精密度不同時間精子VCL檢測結(jié)果

由表6可知，就VSL而言，也呈現(xiàn)隨時間增加而降低的現(xiàn)象，D4密度級別平均VSL普遍高于其他密度級別同一時間節(jié)點(diǎn)的水平；D2組各時間節(jié)點(diǎn)的平均VSL差異不顯著(P>0.05)；D1組中，采精后0 min時檢測的平均VSL水平高于 60 min 時的水平，兩者間差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；D3組中，0 min時的水平顯著高于60 min時的水平(P<0.05)，但兩者與其他各時間節(jié)點(diǎn)的差異均不顯著(P>0.05)。

表6 不同原精密度不同時間節(jié)點(diǎn)下精子VSL檢測結(jié)果

由表7可知，就VAP而言，D1組中，0 min時的平均VAP水平極顯著高于60 min時的水平(P<0.01)；D2組中，各時間節(jié)點(diǎn)間差異不顯著(P>0.05)；D3組中，0 min時的水平顯著高于60 min時的水平(P<0.05)，但兩者與其他時間節(jié)點(diǎn)水平間差異不顯著(P>0.05)；D4組中，0 min時的水平最高，為(43.39±3.70) μm/s，顯著高于60 min時的(31.07 ±3.70) μm/s(P<0.05)。

表7 不同原精密度不同時間節(jié)點(diǎn)下精子VAP檢測結(jié)果

2.3 時間和密度對精子運(yùn)動方式的影響

由表8可知，在LIN、STR、WOB、ALH和BCF中，LIN、STR和WOB變化較平緩，上下波動幅度較小；ALH在各時間節(jié)點(diǎn)都表現(xiàn)出下降的趨勢，但不明顯，0～60 min間下降 0.184 μm，降幅為6.73%，差異不顯著(P>0.05)；在BCF中，0 min 時檢測水平最高，為(6.059±0.197) Hz，之后呈現(xiàn)明顯下降趨勢，至60 min時下降了1.201 Hz，降幅為19.82%，差異極顯著(P<0.01)，0 min時與20、30 min時比較，差異極顯著(P<0.01)。

表8 不同時間下精子其他運(yùn)動參數(shù)檢測結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。

由表9可知，在不同原精密度不同時間節(jié)點(diǎn)下精子BCF檢測結(jié)果總體呈現(xiàn)下降趨勢，D2和D4組中各時間節(jié)點(diǎn)水平間差異不顯著(P>0.05)，采精后60 min時與采精時相比降幅分別為9.53%、13.38%，D1和D3組的下降幅度分別為28.72%、20.89%，與0 min間的差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

3 討論

本試驗采用CASA系統(tǒng)檢測豬精子運(yùn)動參數(shù)，該系統(tǒng)在人類精液檢測中已被廣泛使用，相對于常規(guī)精液分析而言，具有客觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合用于臨床精液標(biāo)本的檢測[4-5]，一般30 s內(nèi)就能完成1個樣本的檢測。

表9 不同原精密度不同時間節(jié)點(diǎn)下精子BCF檢測結(jié)果

精液標(biāo)本從采集到分析的時間間隔是影響精液檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，也是檢測前質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)[6]。在人類精液檢測上，為確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，提供更有價值的參考數(shù)據(jù)給臨床，讓各實(shí)驗室之間的檢驗結(jié)果更具可比性，精液標(biāo)本從采集到分析的時間間隔應(yīng)嚴(yán)格控制[7-9]，推薦的時間間隔為30 min。根據(jù)GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》中的規(guī)定，精液采集后應(yīng)盡快稀釋，放置時間不超過15 min。

關(guān)于檢測時間對精液品質(zhì)影響的報道，張將等研究認(rèn)為，精子濃度和圓細(xì)胞濃度在精液液化后15、30、45、60、90、120 min 較穩(wěn)定，精子活力及活動率在30 min內(nèi)也較穩(wěn)定，30 min 后精子活力顯著下降，45 min后精子活動力也顯著下降，精子活力及精子活動率均與檢測時間呈負(fù)相關(guān)[6]；邵永等研究表明，30、60、90 min檢測的精子活力及活動率均分別顯著低于20 min時檢測的活力及活動率[10]；潘鋒等研究顯示，15、30、60 min內(nèi)精子活力及活動率顯著下降[11]；蒲江波等研究認(rèn)為，人類精子最佳檢測時間為完全液化后的1 h，隨著時間的延長，精子的PR和PR+NP均明顯下降，下降的主要原因是精子能源供給不足[12]，精子活力下降不是呈直線式而是波浪式[12-14]。陳碧等研究了取精后至冷凍前的間隔時間對精子冷凍復(fù)蘇效果的影響，結(jié)果表明精液取出15、30 min后進(jìn)行凍存的精子復(fù)蘇率顯著高于60 min的[15]。

本研究結(jié)果顯示，精子活力和精子活動率大體上均表現(xiàn)為隨時間延長而降低的趨勢，在20 min時均極顯著低于 0 min 的檢測水平，60 min時兩者的檢測水平降幅分別達(dá)29.91%、16.48%。在不同密度級別下，60 min后精子活力檢測結(jié)果降幅不一，D1組中達(dá)45.45%，D4組中僅為7.66%，60 min 后精子活動率檢測結(jié)果降幅亦不一，D1組中達(dá) 26.05%，D4組中為1.20%。結(jié)果表明，密度大的精液緩沖能力強(qiáng)，精子活力降幅小，密度小的精液緩沖能力弱，精子活力降幅大。

VCL、VSL和VAP是以精子頭部為參照物，測定其單位時間內(nèi)精子頭部移動距離或相對位移，可以反映精子的運(yùn)動能力，LIN、STR、WOB、ALH、BCF等指標(biāo)可以用來反映精子運(yùn)動方式，所以認(rèn)為精液在體外放置時間延長不僅降低精子的運(yùn)動能力，又可以影響其運(yùn)動方式[10]。

邵永等研究了精液留取后不同時間對精子運(yùn)動參數(shù)的影響，結(jié)果顯示，BCF在30 min時顯著高于20 min時，90 min時VCL顯著低于20、30 min時，30、60、90 min時的STR與 20 min 時相比顯著降低，90 min時的VAP、VSL分別顯著低于20 min時的[10]。

本研究中，VCL、VSL和VAP等精子運(yùn)動速度指標(biāo)整體均呈現(xiàn)隨精液離體時間延長而下降現(xiàn)象；在VCL方面，精液采集時(0 min)的VCL水平極顯著高于20、30、60 min時，在VSL方面，0 min的VSL水平顯著高于20 min時，極顯著高于精液采集后30、60 min時，在VAP方面，0 min時的VAP水平顯著高于20、30 min時，極顯著高于60 min時。在LIN、STR、WOB、ALH和BCF中，LIN、STR和WOB變化較平緩，上下波動幅度較小，在ALH中，各時間節(jié)點(diǎn)表現(xiàn)出下降的趨勢，但不明顯，差異不顯著(P>0.05)，在BCF中，0 min時檢測水平最高，為(6.059±0.197) Hz，之后呈現(xiàn)明顯下降趨勢，至60 min時下降1.201 Hz，降幅為19.82%，差異極顯著(P<0.01)，0 min 時與20、30 min時比較，差異極顯著(P<0.01)。

隨著時間的延長，精子細(xì)胞脫水，pH值發(fā)生改變，滲透壓的變化及溫度的變化均會造成精子活力、活動率、運(yùn)動參數(shù)等降低，尤其是精漿果糖濃度的降低、絲氨酸蛋白酶活性的改變以及精子DNA的損傷等可能因素的影響，是造成精子活力、活動率和運(yùn)動參數(shù)改變的重要因素[13-15]。

4 結(jié)論

本試驗中，精子活力(PR)、精子活動率(PR+NP)、VCL、VSL和VAP等精子運(yùn)動速度指標(biāo)均表現(xiàn)為隨時間延長而降低的趨勢，密度大的精液緩沖能力強(qiáng)，精子活力和運(yùn)動參數(shù)降幅小，密度小的精液緩沖能力弱，精子活力和運(yùn)動參數(shù)降幅大，精液品質(zhì)檢查和精液稀釋等工作最好在采精后10 min內(nèi)完成。