柚皮苷促進牙周韌帶干細胞增殖和分化的研究

唐琪 柯婷 史丹暉 榮彩麗

[摘要] 目的 探討不同濃度柚皮苷對牙周韌帶干細胞增殖和分化的影響。 方法 分別在含有0.14 mg/mL（低濃度組）和1.4 mg/mL（高濃度組）柚皮苷的細胞培養基上對牙周韌帶干細胞進行培養，并與不含柚皮苷的細胞培養基（空白對照組）培養情況進行對比。在培養1 d、4 d、7 d后對牙周韌帶干細胞的增殖情況進行測定，在培養7 d、14 d后對牙周韌帶干細胞的堿性磷酸酶活性及成骨相關基因[成骨特異性轉錄因子（Runx2）、骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）]的表達進行測定。 結果 高濃度（1.4 mg/mL）的柚皮苷對牙周韌帶干細胞的增殖具有促進作用（P<0.05），對牙周韌帶干細胞的成骨向分化也具有一定的促進作用，能夠顯著提高成骨相關基因（Col Ⅰ、ALP、OCN、Runx2）的表達。 結論 柚皮苷在一定的濃度和時間下，能促進牙周韌帶干細胞的增殖與成骨向分化。

[關鍵詞] 牙周韌帶干細胞;柚皮苷;骨組織工程;牙周再生醫學

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）33-0030-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of different concentrations of naringin on the proliferation and differentiation of periodontal ligament stem cells. Methods The periodontal ligament stem cells were respectively cultured on the cell culture medium containing 0.14 mg/mL naringin（low concentration group） and 1.4 mg/mL naringin（high concentration group）， and compared with the cell culture medium without naringin （blank control group）. The proliferation of periodontal ligament stem cells was measured after 1， 4 and 7 days of culture. The activity of alkaline phosphatase and the expression of osteogenic related genes （Runx2， OCN， ALP， Col Ⅰ） in periodontal ligament stem cells were measured after 7 and 14 days of culture. Results The high concentration （1.4 mg/mL） of naringin promoted the proliferation of periodontal ligament stem cells. It also played a role in promoting the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells and significantly increased the expression of osteogenesis related genes （Col Ⅰ， ALP， OCN， RUNX2） （P<0.05）. Conclusion Naringin can promote the proliferation and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells at a certain concentration and time.

[Key words] Periodontal ligament stem cells; Naringin; Bone tissue engineering; Periodontal regenerative medicine

牙周病作為患病率很高的口腔慢性感染性疾病，迄今無根治方法，主要原因是牙槽骨炎性吸收的修復和再生存在困難。牙槽骨高度的降低和牙齦退縮引發的美觀和功能上的問題難以解決[1]。盡管開展的骨移植和引導牙周組織再生（Guided tissue regeneration，GTR）術已取得一定的進展，但因其不能使牙周膜細胞數量明顯增加和生物相容性問題，在恢復牙周組織的生理結構和功能上還未達到所期望的目標[2]。柚皮苷是一種二氫黃酮類化合物，提取自蕓香科植物柚等的外殼，是中藥骨碎補的主要作用成分[3]。改變給藥方式直接作用于靶細胞或搭載局部生物支架緩釋控制給藥時限或為高柚皮苷對牙周病療效的可能途徑[4，5]。

牙周韌帶干細胞（Periodontal ligament stem cell，PDLS）即牙周膜中的未分化間充質細胞，是一類具有異質性和分化潛能的細胞，具備成體干細胞的特性，是牙周組織再生的重要細胞來源[6]。誘導PDLS定向分化可以獲得更多的目標功能細胞，減少非目標細胞的自發分化。而且PDLS來源有限，牙周病拔除的牙齒因缺乏健康的牙周膜和潛在的細菌感染風險而不能使用[7]，來源于健康的第三磨牙和正畸減數拔除的牙齒數量非常有限。因此采用細胞因子或細胞因子替代產品或細胞因子強化放大產品如中藥某些有效成份擴增干細胞數量并誘導其定向分化為目標功能細胞具有非常重要的意義[8]。本實驗旨在通過體外細胞培養技術，觀察柚皮苷對牙周韌帶干細胞增殖與成骨向分化的影響，為柚皮苷用于牙周病的治療提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器

柚皮苷（阿拉丁公司，中國）、DMEM培養基（Gibco，美國）、胎牛血清（FBS）（Gibco，美國）、細胞凍存液（索萊寶，中國）、CCK-8試劑盒（同仁，日本）、堿性磷酸酶試劑盒（碧云天、中國）、CO2恒溫培養箱（賽默飛，美國）、稱量天平（美國Ohaus公司）、-20°C冰箱（賽默飛，美國）、-80°C冰箱（賽默飛，美國）、臺式離心機（德國Heraeus公司）、無菌超凈操作臺（賽默飛，美國）、恒溫水浴鍋（上海醫用恒溫設備廠）、制冰機（美國Ross Temp公司）、光學顯微鏡系統（日本OLYMPUS公司）、酶標比色儀（美國Bio-Rad公司）、微流移液器（德國Eppendorf公司）、NanoDrop 2000C（賽默飛，美國）、PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人牙周韌帶干細胞的原代培養? 取12～24歲患者因正畸或阻生而拔除的牙體牙周均健康的新鮮牙齒，冠根單向刮取根中1/3牙周膜，將組織塊修剪為1 mm×1 mm×1 mm，Ⅰ型膠原酶37℃振蕩消化10 min，大部分細胞游離，用吸管吹打使其充分分散，加入至含有10% FBS的DMEM培養基中終止消化。離心機1000 r/min離心5 min，棄去上清液，重旋沉淀，均勻接種在6 cm直徑培養皿中，將培養皿置于37℃、5% CO2飽和濕度的孵箱中。細胞長至孔底60%左右時，進行胰酶消化、傳代，取3～5代細胞進行后續研究。

1.2.2 CCK-8法測定柚皮苷對人牙周韌帶干細胞增殖的影響? 取生長良好的第3代牙周韌帶干細胞，以1×104個/mL的濃度接種于96孔培養板，每孔接種100 μL。24 h后，棄去培養液，依照不同柚皮苷濃度（0 mg/mL、0.14 mg/mL、1.4 mg/mL）進行分組，分為兩個實驗組和一個對照組，每組設3個復孔。在培養1 d、4 d、7 d后，將DMEM培養基與CCK-8試劑按9：1配置成混合液，每孔加入100 μL，置于培養箱2 h后，以空白對照孔調零，于450 nm波長處測定吸光度（Optical density，OD）。

1.2.3 柚皮苷對人牙周韌帶干細胞堿性磷酸酶活性的影響? 取生長良好的第3代牙周韌帶干細胞，以2×105個/mL的濃度接種于24孔培養板，每孔接種100 μL。24 h后，棄去培養液，依照不同柚皮苷濃度（0 mg/mL、0.14 mg/mL、1.4 mg/mL）進行分組，分為兩個實驗組和一個對照組，每組設3個復孔。在培養7 d、14 d后，利用堿性磷酸酶試劑盒測定樣本內細胞堿性磷酸酶活性。

1.2.4 柚皮苷對人牙周韌帶干細胞成骨相關基因的影響? 取生長良好的第3代牙周韌帶干細胞，以2×105個/mL濃度接種于24孔培養板，每孔接種100 μL。24 h后，棄去培養液，依照不同柚皮苷濃度（0 mg/mL、0.14 mg/mL、1.4 mg/mL）進行分組，分為兩個實驗組和一個對照組，每組設3個復孔。在培養7 d、14 d后，通過Real-Time PCR對各組人牙周韌帶干細胞的成骨特異性轉錄因子（Runx2）、骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）的基因表達進行檢測。吸凈24孔培養板中的培養基，PBS緩沖液清洗3次后，向孔中加入800 μL Trizol裂解液，冰上反復吹打支架，使細胞充分裂解，收集裂解液，轉至離心管中，加入200 μL三氯甲烷后充分振蕩15 s，冰上靜置3 min。4℃，12000 g離心15 min，取上清液400 μL至另一離心管中，加入400 μL異丙醇，充分混勻后冰上靜置10 min，4℃，12000 g離心10 min。充分上清液后加入1 mL無水己醇洗滌沉淀，4℃，7500 g離心5 min后棄去液體，靜置3 min，待乙醇完全揮發后加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀，60℃金屬浴5 min，用NanoDrop 2000C測定抽提RNA的濃度和純度。提取1 μg RNA進行逆轉錄，利用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以GAPDH為內參，構建PCR反應體系[20 μL、cDNA 1 μL、引物各0.5 μL（表1）、SYBR Green Master mix 10 μL、雙蒸水8 μL]。將配好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行擴增反應，反應條件為95℃，1 min，緊接40個PCR循環（95℃，15 s;64℃，25 s，收集熒光）。反應完成后進行擴增曲線和熔解曲線分析，基因表達量以檢測基因的初始模板量表示（2-△△Ct）。

1.3 統計學方法

所有實驗數據使用SPSS 16軟件進行分析，行單因素方差分析，數據以均數±標準差（x±s）表示。P<0.05為差異有統計學意義，P>0.05為差異不顯著。每組實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1 人牙周韌帶干細胞的原代培養

原代培養的組織塊，經過3～5 d，爬出梭形細胞，約7 d后可長滿培養皿底部。細胞呈細長狀，核圓形或卵圓形。經傳代，3～5代內生長迅速，細胞形態不發生改變。免疫組化抗細胞角蛋白染色陰性，抗波形蛋白多克隆抗體陽性。穩定培養的3～5代細胞用于實驗。

2.2 CCK-8法測定柚皮苷對人牙周韌帶干細胞增殖的影響

對比0、0.14、1.4 mg/mL濃度柚皮苷的三種培養基在1、4、7 d對人牙周膜干細胞增殖情況的影響。圖1顯示經CCK-8試劑盒檢測后所得OD值。在第1天，細胞增殖情況隨柚皮苷濃度增加略有上升，但無明顯差異（P>0.05）。在第4天，0.14 mg/mL低濃度組（0.56±0.02）略高于無柚皮苷空白對照培養基組（0.52±0.01），但無顯著性差異（P>0.05），1.4 mg/mL高濃度組（0.62±0.01）的細胞增殖顯著高于無柚皮苷空白對照培養基組（P<0.05）。在第7天，0.14 mg/mL低濃度組（0.64±0.03）高于無柚皮苷空白對照培養基組（0.63±0.02），仍無顯著性差異（P>0.05），而1.4 mg/mL高濃度組（0.72±0.02）的細胞增殖顯著高于其他兩組（P<0.05）。

2.3 柚皮苷對人牙周韌帶干細胞堿性磷酸酶活性的影響

圖2顯示人牙周韌帶干細胞在0、0.14、1.4 mg/mL濃度柚皮苷的三種培養基中7、14 d細胞堿性磷酸酶活性。可以看到，隨著時間的推進和柚皮苷濃度的升高，人牙周韌帶干細胞堿性磷酸酶活性也隨之顯著升高（P<0.05）。0、0.14、1.4 mg/mL濃度柚皮苷在7 d時的堿性磷酸酶活性分別為（61.02±3.74）、（72.33±2.05）、（90.11±1.97）;而高濃度的柚皮苷使得牙周膜干細胞堿性磷酸酶活性上升更大。

2.4 柚皮苷對人牙周韌帶干細胞成骨相關基因的影響

2.4.1 7 d時柚皮苷對人牙周韌帶干細胞成骨相關基因的影響? 圖3顯示人牙周韌帶干細胞經不同濃度柚皮苷培養7 d后細胞成骨相關基因的表達。在第7天，0、0.14、1.4 mg/mL柚皮苷濃度三組間ColⅠ基因相對表達量均有顯著性差異[（1.03±0.08）、（1.25±0.04）、（1.81±0.08）]，隨著柚皮苷的濃度增加，差異逐漸增大（P<0.05）。而三組間OCN基因的表達無明顯差異。在第7天時，1.4 mg/mL高濃度組的ALP基因表達（2.11±0.06）顯著高于空白對照組（1.17±0.12）和低濃度組（1.31±0.20）（P<0.05）。三組間的Runx2基因的表達量隨著柚皮苷濃度上升而呈現上升趨勢，然并未有顯著性差異（P>0.05）。

2.4.2 14 d時柚皮苷對人牙周韌帶干細胞成骨相關基因的影響? 圖4顯示人牙周韌帶干細胞經不同濃度柚皮苷培養14 d后細胞成骨相關基因的表達。在第14天，三組間Col Ⅰ基因相對表達量均有顯著性差異，分別為（1.01±0.10）、（2.61±0.07）、（3.07±0.12）（P<0.05）。三組間OCN基因的表達隨柚皮苷濃度上升而上升，1.4 mg/mL濃度組的基因表達量（2.20±0.23）顯著高于空白對照組（1.80±0.38）和低濃度組（1.47±0.12）（P<0.05）。但0.14 mg/mL低濃度組與空白對照組間無明顯差異（P>0.05）。在第14天時，三組間的ALP基因表達量均有顯著差異，且隨柚皮苷濃度提高而提高，分別為（1.31±0.18）、（2.23±0.12）、（2.51±0.21）（P<0.05）。在第14天，1.4 mg/mL高濃度組的Runx2基因的表達量（2.20±0.16）顯著高于空白組（1.59±0.14）和低濃度組（1.71±0.07）（P<0.05）。

3 討論

牙周病是發生于牙周組織的慢性感染性疾病，其主要病理改變是牙周袋形成和牙槽骨吸收。牙周病不僅危害牙周健康、口腔健康，也影響全身健康，與全身疾病有著密切關系。結合干細胞治療及生物因子促進的牙周細胞組織工程學為近年來研究的熱點，為牙周組織再生提供了新的選擇[9]。其中種子細胞的選擇具有重要的意義[10]，必須具備干細胞的特性，可以分化成為軟硬組織新生的功能細胞和合成細胞[11]。口腔內相關的干細胞主要來自于牙髓、牙周膜、牙囊和牙齦乳頭等牙周組織[12]。這類細胞容易獲得，具有多項分化潛能，并可以自體移植。牙周韌帶干細胞已在今年的研究中被證實具有多向分化潛能，能分化成為牙周組織中所需要的纖維、牙槽骨、牙骨質等多種組織。但牙周韌帶干細胞經過傳代后分化潛能下降，需要一些生物因子或其他昂貴的藥物提高其增殖分化活性，而這些細胞因子價格昂貴難以推廣[13]。采用確切、高效和經濟的方法擴增和誘導干細胞定向分化對推廣牙周組織工程的運用是非常必要的。中醫中藥是我國傳統醫學的寶庫。骨碎補是水龍骨科斛蕨的干燥根莖（Drynaria fortunei），性溫，味苦，具有療傷止痛，補腎強骨的功效。臨床上使用的補腎固齒丸主要組分即為骨碎補，但因其作用成份龐雜，口服給藥經機體代謝吸收有限而對牙周組織再生重建的療效不佳。目前已有相關文獻研究證實中藥骨碎補提取液具有促進成骨細胞株MC3T3-E1細胞增殖、分化和基質礦化的作用[14]，以及對實驗性大鼠牙槽骨吸收模型的促成骨療效，以及將柚皮苷與生物材料相結合來修復骨缺損[15，16]。但其作用機制不明。而骨碎補的主要有效成分為以柚皮苷為主的二氫黃酮類化合物。這為取得廉價高效的骨促進生物因子提供了可能性。

本實驗通過CCK-8法對不同濃度的柚皮苷溶液對牙周韌帶干細胞增殖的影響進行研究。發現牙周韌帶干細胞的增殖對柚皮苷的濃度呈一定的正比關系。且在一周內，高濃度（1.4 mg/mL）的柚皮苷溶液能顯著增強牙周韌帶干細胞的增殖。低濃度（0.14 mg/mL）的柚皮苷溶液能提高牙周韌帶干細胞的增殖，但可能由于藥物濃度過低，沒有引起顯著性的差異。

堿性磷酸酶是一種膜結合蛋白[17]，是細胞成骨向分化的一種標志性蛋白，在成骨細胞礦化中起著重要的作用。實驗中，不論是高濃度組還是低濃度組都表現出對牙周韌帶干細胞堿性磷酸酶活性的顯著促進。說明可能只需要較低的有效濃度，柚皮苷即可促進牙周韌帶干細胞的成骨向分化及成骨礦化能力。

成骨相關基因表達的檢測中，我們發現在整個實驗周期，不論是高濃度組還是低濃度組，都能夠顯著促進牙周韌帶干細胞Col Ⅰ表達的提高。Col Ⅰ是牙周組織中含量最多的膠原，是骨的含量最多的一種纖維基質，在早期成骨中有著重要的作用。OCN與Runx 2兩種基因在7 d時，三組間未有明顯差異，而在14 d時，高濃度組有明顯表達，這可能由于這兩種基因出現在成骨中后期，且柚皮苷引起這兩種基因高表達的有效濃度較高。ALP基因的表達情況與2.2中堿性磷酸酶的表達情況較為一致，驗證了柚皮苷對牙周韌帶干細胞成骨向分化及礦化的促進作用。

綜上所述，挖掘中醫中藥中的有效作用因子，將其與現代牙周組織工程技術相結合。能夠為組織工程解決方案提供高效、經濟的新的技術方式。柚皮苷，作為一種植物來源的化合物，有望在牙周組織再生中作為成骨促進因子進行作用[18]。還有相關研究表明，其對于免疫調節[19，20]、抑菌抗炎[21，22]也有一定的作用。這些作用的機制還有待進一步的探索。

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（收稿日期：2019-07-15）