蛋白質動態運動在生物化學實驗中的教學實踐研究

魏旭旭

[摘? ? ? ? ? ?要]? 在本科生物化學實驗中進行蛋白質動態運動實驗，主要利用了G蛋白偶聯受體內吞的原理，與綠色熒光蛋白與熒光蛋白顯微成像的技術結合起來，對受體蛋白內吞的過程以及動態運動進行觀察，這種實驗具有操作性強、結果清晰和直觀等特點，讓生物化學本科教學的內容得到不斷的擴展，使學生對蛋白質的運動特征理解更加深入，從而將學生設計實驗以及進行實驗的綜合能力有效提高。主要對蛋白質動態運動在生物化學實驗中的教學實踐進行探討，希望能夠提供一定的參考價值。

[關? ? 鍵? ?詞]? 蛋白質動態運動;生物化學;實驗教學

[中圖分類號]? G712? ? ? ? ? ?[文獻標志碼]? A? ? ? ? ? ? [文章編號]? 2096-0603（2019）31-0292-02

目前在高校進行生物化學實驗教學的主要內容是對體外非細胞體系的測試性進行實驗，比如檢測酶的活性、測定蛋白質的濃度等，而對細胞內蛋白質動態運動進行實驗的教學非常少，通過有效利用相關的原理和熒光蛋白顯微成像的技術，讓學生能夠對受體蛋白在細胞內進行內吞運動以及回膜運動進行觀察和實驗，并且還能對下游招募蛋白的定位和運動同時進行觀察，這種實驗模型不僅能研究膜受體的內吞機制基礎，還能篩選出受體的藥物，具有非常大的推廣價值。

一、蛋白質動態運動的實驗原理

G蛋白偶聯受體在真菌和哺乳動物的生命體中廣泛存在，是一種具有高保守性的細胞膜蛋白超家族。在細胞外其信號主要是通過GPCRs傳遞信息至細胞內部，并能充分發揮調控的作用，該類信號傳輸系統能夠緊密聯系人體內部的疾病，比如肥胖、糖尿病、骨質疏松等，所以GPCRs一直是研發新藥的重要因素。當GPCRs中的激動劑一直存在時，將會在幾分鐘或幾個小時內降低引起細胞膜表面的受體數量，則會發生內吞運動，之后GPCRs就會呈現出反應性的降低情況，這種現象被稱為受體失敏現象，GPCRs進行內吞以及失敏是對GPCRs介導的信號轉導進行調節的重要內容。進行內吞運動后，受體可以通過內含體循環運動回到細胞膜表面，從而完成復敏，還可以被送到溶酶體中進行不可逆的降解工序。

二、蛋白質動態運動在生物化學實驗中的具體實驗步驟

（一）提取并檢測質粒

在本實驗中所使用的質粒包括FPR1-pEGFP、PCMV-FPR1等，在大腸桿菌中轉化所用的質粒，并擴大培養搖菌，使用專用的去除內毒素質粒提取試劑盒將相關的質粒提取出來，并用紫外分光光度法定量分析所有提取的質粒。

（二）培養相關的細胞

本實驗中使用的細胞株為人胚胎腎細胞HEK293，用FBS（10%）的DMEM/Low Glucose的培養基在37℃的溫度以及CO2濃度為5%的培養箱中對其進行培養，當細胞的匯合度達到一定標準時（80%～90%），再對其進行稀釋，比例為1∶3～1∶5。

（三）轉染工序

HEK293細胞的生長狀態比較良好，將其繼續接種在有6個孔的培養板中，其密度值為3×105～5×105，繼續在37℃的溫度下以及CO2濃度為5%的培養箱中對其培養，時間長度一般為18～24h，當細胞匯合度達到80%～90%的標準時，再使用Lipofectamine對其進行轉染工序，轉染后繼續培養4～6h之后，將其換入新鮮的培養基中繼續培養8～12h，目前比較常使用的轉染方案是將6孔培養板中其中2孔的細胞進行轉染，直接對FPR1-GFP的受體蛋白進行觀察，主要觀察發生的內吞運動，其他4孔細胞主要用于對FPR1被配體激活后輔助蛋白的動態變化進行觀察，在該實驗中學生可以根據實際的情況對設計的方案進行調整。

（四）研究受體的定位以及內吞運動

首先需要在有滅菌蓋玻片的6孔板中平均分配6孔板中轉染后的HEK293細胞，讓細胞在滅菌蓋玻片上進行生長，在溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養箱中培養18～24h，并且在進行實驗的當天觀察細胞的匯合度是否達到70%～80%，在6孔板中將其中2孔的細胞提前加入蛋白質合成的抑制劑放線菌酮進行過夜培養，然后使用激動劑對已經轉染的細胞進行孵育，孵育時常分別為0min、5min、30min、45min，主要是對激動劑處理時間不同受體蛋白發生的定位以及內吞運動進行觀察，再配置出不同濃度的激動劑fMLP對其進行稀釋，在37℃，CO2濃度為5%的培養箱中孵育45min，對不同濃度激動劑對FPR1受體內吞運動的影響進行觀察，待孵育完畢后吸出待檢細胞中的細胞培養基，并使用PBS對細胞進行漂洗，漂洗后，首先使用多聚甲醛（濃度為4%）在室溫中固定10min，再在6孔板中取出玻片，將其放置在滴有甘油的蓋玻片上進行封片，最后使用熒光顯微鏡對綠色熒光蛋白的分布進行觀測。

三、實驗結果

（一）對不同時間的激動劑作用下FPR1從細胞膜到包漿的內吞運動進行觀察

使用FPR1激動劑fMLP對有FPR1-pEGFP的細胞進行刺激轉染，并在溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養箱中分別孵育0、5、30以及45min，用使用熒光顯微鏡對融合蛋白的定位進行觀察，其膜受體蛋白內存運動的具體過程如圖1所示。

由圖1可以看出，在0min時加不加激動劑，受體蛋白主要在細胞膜上表達，而在5min時，部分的受體蛋白已經形成顆粒狀，并出現了內吞運動，但是細胞膜上還存在一部分的受體蛋白。

（二）對激動劑濃度不同作用于FPR1后的受體內吞運動進行觀察

使用不同濃度的FPR1激動劑對有FPR1-pEGFP的細胞進行刺激轉染，濃度分別為1μmol/L、100nmol/L以及10nmol/L，在溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養箱中孵育45min，并使用熒光顯微鏡對受體蛋白的定位進行觀察，其實主要的內吞運動如圖2所示。

由圖2可以看出，當激動劑為低濃度10nmol/L時，受體蛋白沒有發生內吞運動，而在100nmol/L的刺激下，則開始發生部分的內吞運動，最后使用高濃度1μmol/L激動劑時，幾乎全部發生了內存運動，這說明在受體蛋白內吞的數量與激動劑的濃度存在一定的關聯。

四、結語

通過在生物化學實驗中進行蛋白質動態運動的教學實踐，可以了解到這種教學實踐能夠將實驗的思考有效擴展開來，并且讓學生學習到熒光蛋白顯微成像技術，具有較強的綜合性，也能積極調動學生學習的積極性，最后實驗的結果也非常直觀，能夠讓學生對蛋白質在信號刺激以及一系列分子事件當中的運動和相關機制得到更加深入的認識和了解，促進學生得到全面發展。

參考文獻：

史影，王偉偉，葉伶燕，等.蛋白質動態運動在生物化學實驗中的教學實踐[J].實驗技術與管理，2019，36（1）：24-27.

編輯 陳鮮艷