瑪咖結(jié)合運動療法對糖尿病大鼠腎線粒體呼吸鏈酶活性及腎功能的影響

彭麗娜，寧尚斌，王光光，常世民，張玉峰，李艷霞

(廊坊師范學(xué)院運動人體科學(xué)教研室，河北 廊坊 065000)

線粒體呼吸鏈(respiratory chain)的作用是線粒體的最基本功能。線粒體呼吸鏈又稱電子傳遞鏈，由線粒體內(nèi)膜上的電子載體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ即呼吸鏈酶RCCI～RCCIV構(gòu)成，主要接受代謝物NADH和FADH2脫下的氫或電子，經(jīng)過復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ中NAD+、NADP+和FAD載體傳遞給氧生成水并釋放ATP的過程。線粒體呼吸鏈酶缺陷是造成很多疾病的源泉[1]。腎主骨生髓，乃先天之本，生命之根，君主之官。腎功能健全是保證機體機能正常運轉(zhuǎn)的根本[1]。腎線粒體呼吸鏈酶的活性直接影響能量輸出ATP時傳遞氫離子或是電子的速率，影響腎功能[2]。實驗證明，瑪咖能顯著降低線粒體丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，提高老齡小鼠心、肝組織血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，具有緩解體力疲勞的功能[3-4]。課題組前期實驗證明，瑪咖可以提高老齡大鼠腎、腦組織線粒體呼吸鏈酶活性和提高抗衰老能力；也可以改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌組織ATP的消耗，緩解心肌損傷的發(fā)生[5-7]。在前期研究成果的基礎(chǔ)上，本文探討補充瑪咖結(jié)合運動療法對老齡糖尿病大鼠腎線粒體呼吸鏈酶活性及腎功能的影響，為機體能量代謝性疾病及預(yù)防、康復(fù)手段提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠60只，體重(450 ± 20) g，12月齡。購于北京維通利華[SCXK (京) 2016-0001]。大鼠飼養(yǎng)于本單位動物房[SYXK (冀) 2016-0011]，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，溫度25℃左右，每周進行一次紫外燈消毒。在實驗過程中嚴格遵循實驗動物福利倫理相關(guān)規(guī)定和要求，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素、NADH、魚藤酮、細胞色素C、抗霉素、阿霉素等為Sigma公司產(chǎn)品；硫脲、硼酸、鄰甲苯胺、冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖等藥品為國產(chǎn)；血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血糖試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。北京信康億達YDX-3液氮罐、YQ-3型電動勻漿機；低溫高速離心機(德國Hettich 320/320R)；紫外可見光分光光度計(日本島津UVmini-124)；大鼠跑臺(杭州)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物造模

高糖高脂飼料喂養(yǎng)一個月后腹腔注射鏈佐霉素(40 mg/kg，用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液溶解，pH=4.0)，每天一次，連續(xù)4 d。兩天后再按照100 mg/kg劑量腹腔注射四氧嘧啶水溶液[8-9]。造模成功后，保留40只模型大鼠。

1.3.2 實驗動物分組與瑪咖干預(yù)

一個月后淘汰模型失敗及死亡大鼠，最終保留40只大鼠參與模型實驗。隨機分成4組，每組10只，分為模型對照組、瑪咖組、運動組和瑪咖+運動組。根據(jù)國內(nèi)大鼠運動模型[10]，運動和瑪咖+運動兩組動物進行跑臺訓(xùn)練(每周5 d，每天一次)，速度從12 m/min遞增到27 m/min，每周遞增3 m/min；時間從20 min遞增到45 min，每周遞增5 min。瑪咖組和瑪咖+運動組大鼠每次運動后以5 g/kg瑪咖粉[11]給予大鼠灌胃。一個半月訓(xùn)練結(jié)束后所有動物(除模型對照組)以運動速度35 m/min[10]運動至力竭。

1.3.3 腎標本制備及線粒體的提取

力竭后即刻麻醉取血并解剖取出雙腎，冰浴中除去結(jié)締組織并剪成碎塊制成勻漿液(1∶5加入緩沖液)。勻漿液兩次離心(600 r/min，15 min)，棄沉淀，取上清；懸浮后再離心(12 000 r/min，15 min)，棄上清，留固體沉淀，再次與250 mmol/L蔗糖等懸浮液混合后再離心(12 000 r/min，15 min)，沉淀物即為腎線粒體[12]。

1.3.4 腎線粒體呼吸鏈酶活性及血尿素氮、血清肌酐、血糖水平的測定

考馬斯亮藍G250測定蛋白含量。形態(tài)學(xué)指標采用甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察結(jié)構(gòu)變化。在25℃室溫下，測定腎線粒體呼吸鏈酶活性。將10 μL線粒體蛋白加入到酶RCCI～RCCIV反應(yīng)緩沖液2 mL中，連續(xù)測定3 min內(nèi)NADH、FADH2、細胞色素C還原酶與細胞色素C氧化酶340、600、550、550 nm處吸光值的變化表示腎線粒體呼吸鏈酶RCCI～RCCIV的活性[13]。血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血糖的測定嚴格按照試劑盒的操作程序進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

光鏡下放大1500倍觀察線粒體結(jié)構(gòu)顯示，糖尿病大鼠腎線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)不一。對照組腎線粒體呈現(xiàn)壞死、腫脹、斷裂、紊亂、異常、界限間隙增加；瑪咖組線粒體排列較對照組線粒體腫脹、損傷、斷裂、變性情況有所減輕，界限稍明顯；運動組和瑪咖組類似，線粒體排列界限模糊、紊亂，腫脹、損傷、斷裂、變性程度仍很大，但相對于對照組有所改善；瑪咖+運動組腎線粒體病理有明顯改善，結(jié)構(gòu)排列比前三組緊密、紋理稍清晰、整齊，壞死、腫脹、斷裂情況明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。

注：A：對照組；B：瑪咖組；C：運動組；D：瑪咖+運動組。圖1 各組大鼠腎線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化(×1500)Note. A: Control group; B: Maca group; C: Training group; D: Maca + training group.Figure 1 Morphological and structural changes of mitochondria in rat kidneys of each group

2.2 各組大鼠腎線粒體呼吸鏈酶活性的變化

與對照組比較，瑪咖組大鼠腎線粒體呼吸鏈RCCI、RCCIII、RCCIV活性分別提高14.14%、11.92%和18.42%(P> 0.05)，RCCII活性提高32.86%(P< 0.01)；與對照組比較，運動組RCCI、RCCII活性分別提高36.81%和26.12%(P< 0.01或P< 0.05)，RCCIII、RCCIV活性分別提高8.73%和12.51%(P> 0.05)；與對照組比較，瑪咖+運動組RCCI、RCCII、RCCIV活性分別提高48.21%、38.89%和25.10%(P< 0.01或P< 0.05)，RCCIII活性提高14.89%(P> 0.05)。與瑪咖組比較，瑪咖+運動組RCCI、RCCII活性分別提高39.68%和31.18%(P< 0.01)，RCCIII、RCCIV活性分別提高3.37%和8.18%(P> 0.05)。與運動組比較，瑪咖+運動組RCCI、RCCIII、RCCIV活性分別提高18.05%、6.74%和14.39%(P> 0.05)，RCCII活性提高37.46%(P< 0.01)。見表1。

2.3 各組大鼠腎功能的變化

與對照組比較，瑪咖組、瑪咖+運動組大鼠血尿素氮含量分別降低25.37%和35.47%(P< 0.05或P< 0.01)，運動組降低17.65%(P> 0.05)；與對照組比較，瑪咖組血清肌酐降低18.86%(P> 0.05)，運動組、瑪咖+運動組分別降低25.20%和38.66%(P< 0.05或P< 0.01)；與對照組比較，瑪咖組血糖水平降低18.15%(P> 0.05)，運動組、瑪咖+運動組分別降低28.13%和45.28%(P< 0.05或P< 0.01)。與瑪咖組比較，瑪咖+運動組血尿素氮含量降低13.54%(P> 0.05)，血清肌酐、血糖水平分別降低24.39%、33.14%(P< 0.05或P< 0.01)。與運動組相比，瑪咖+運動組血尿素氮、血糖水平分別降低21.65%、23.86%(P< 0.05)，血清肌酐含量降低17.99%(P> 0.05)。見表2。

3 討論

3.1 各組大鼠腎線粒體呼吸鏈酶活性的變化

研究表明，有氧運動可以改善胰島素抵抗、提高血管內(nèi)皮功能、提高線粒體呼吸鏈酶活性及抗氧化酶活性，降低血糖水平及炎癥的發(fā)生[14-16]。也有研究表明，瑪咖結(jié)合運動訓(xùn)練可以提高老年大鼠腎線粒體呼吸鏈酶活性，降低大鼠線粒體MDA含量，防治線粒體功能的退行性變化，延緩機體衰老[5]。本實驗結(jié)果顯示，一個半月有氧運動訓(xùn)練、瑪咖干預(yù)、瑪咖+運動干預(yù)均可改善糖尿病大鼠腎線粒體呼吸鏈酶活性，提高機體能量代謝速率，且瑪咖+運動組效果更加顯著。本實驗還發(fā)現(xiàn)，對于瑪咖結(jié)合運動療法在改善糖尿病大鼠線粒體呼吸鏈酶活性中，長期運動對呼吸鏈的起始酶——FADH2還原酶(RCCII)最為敏感，而補充瑪咖主要影響NADH還原酶(RCCI)。分析其機制可能是糖尿病大鼠本身的腎組織處于高代謝狀態(tài)，腎小球內(nèi)壓及濾過率加大，腎小球的硬化速度加快及部分出現(xiàn)增值肥大[17-18]，電解質(zhì)、體液失衡，細胞外基質(zhì)增加，甘油三酯脂酶、NADH還原酶等活性下降，造成機體免疫力下降[19]；而有氧運動可以提高脂蛋白脂酶的活性，增加β-細胞胰島素分泌，降低由于糖脂超載而造成的血管壓力，減輕由于機體代謝紊亂而造成的機體損害[20]，減輕腎小管上皮細胞間質(zhì)纖維化，降低腎小球內(nèi)壓及濾過率，F(xiàn)ADH2還原酶作為呼吸鏈的啟動酶系傳遞電子或H+功能加強，提高腎線粒體產(chǎn)生良性適應(yīng)，氧化磷酸化功能倍增[21]；另外，瑪咖中含有豐富的瑪咖烯、瑪咖酰胺、芥子油苷、生物堿等調(diào)節(jié)腎上腺、胰腺等功能，平衡荷爾蒙分泌，加強腎活力[22]；瑪咖中還含有亞油酸、亞麻酸、牛黃酸、賴氨酸、谷氨酸，鐵、鋅等營養(yǎng)成分，能加固免疫系統(tǒng)，清除過量的自由基，調(diào)節(jié)腎線粒體內(nèi)膜NADPH氧化酶活性[23]，防止胰島素抵抗，減輕受損腎細胞修復(fù)，降低腎耗氧量，提高腎產(chǎn)能速率，延緩機體疲勞及衰老速度、激活腎功能來提高線粒體能量代謝[24]。總之，補充瑪咖結(jié)合運動療法可提高糖尿病大鼠腎線粒體呼吸功能，提高機體能量輸出速率。

表1 各組大鼠腎線粒體呼吸鏈酶活性的變化Table 1 Changes in mitochondria respiratory chain enzyme activities in rat kidneys of each group

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與瑪咖組比較，##P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the Maca group,##P< 0.01.

表2 各組大鼠腎功能的變化Table 2 Changes in renal function of rats in each group

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與瑪咖組比較，#P< 0.05。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the Maca group,#P< 0.05.

3.2 各組大鼠腎功能的變化

血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血糖是檢查腎功能的常用指標，但易受各種因素的影響，如攝入高脂、高糖、高蛋白食物，飲酒、情緒波動等均可使血尿素氮、血清肌酐、血糖水平升高[17-18]。研究顯示，有氧運動能有效降低糖尿病大鼠血尿素氮水平和血糖含量，改善大鼠糖、脂代謝和胰島素抵抗，提高腎線粒體結(jié)構(gòu)，減輕腎功能損傷[25]。另一研究表明，瑪咖干預(yù)可提高機體抗疲勞能力[3]。本實驗數(shù)據(jù)顯示，運動療法、瑪咖干預(yù)、運動+瑪咖干預(yù)均可降低糖尿病大鼠血尿素氮、血清肌酐、血糖水平，且運動療法結(jié)合瑪咖干預(yù)組效果大于另外兩組；本實驗還顯示，補充瑪咖主要影響血尿素氮含量，而在改善血清肌酐和血糖水平方面效果并不顯著，6周遞增負荷運動可以明顯降低血清肌酐、血糖水平，但在改善血尿素氮方面并不十分理想。

分析其機制可能是腎病理刺激加上大強度運動的雙重刺激，使得腎線粒體MDA、ROS、H2O2等產(chǎn)物增加[17]，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈酶活性及糖酵解酶活性下降，線粒體DNA缺失加大，引起線粒體功能障礙，ATP合成能力受阻所致[26]；而長期科學(xué)的有氧運動訓(xùn)練可以增加胰島素敏感性，增強與受體的親和力，降低低密度脂蛋白膽固醇，提高機體免疫力[27]；同時，線粒體功能損害在糖尿病中起著重要的作用，血尿素氮、血清肌酐、血糖紊亂可以引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能上的改變，適當(dāng)?shù)倪\動結(jié)合瑪咖本身具有的抗氧化活性的雙重效應(yīng)可以調(diào)節(jié)血管通透性，維持腎小球及線粒體膜結(jié)構(gòu)功能完整性，清除自由基，減少腎小管的重吸收及清除率[28]，降低血糖及VEGF-A和VEGFR2蛋白水平，提高長鏈脂酰輔酶A活性，減少血脂，減輕大鼠腎損傷，提高機體免疫力及改善糖尿病大鼠腎功能[29]。

總之，糖尿病的發(fā)病機制很多，應(yīng)該根據(jù)腎病理結(jié)合血液、尿液、遺傳病史以及臨床癥狀等多方面因素加以考慮，對癥下藥。本實驗方案依據(jù)運動結(jié)合營養(yǎng)補劑從能量代謝性疾病方面來改善糖尿病大鼠腎功能，為預(yù)防疾病和臨床康復(fù)提供參考。但糖尿病患者要注意運動強度、時間、膳食以及心情，制定適合自己的運動方案，達到運動降糖、降壓、減脂、提高心肺及腎功能，減少藥物攝入，改善糖尿病患者癥狀的目的。