超高效液相色譜法測定門冬胰島素含量

梅 麗，栗鳳娟，楊 樺

（江蘇萬邦醫藥科技有限公司，江蘇 徐州 221004）

胰島素是治療糖尿病的有效藥物[1]，但普通胰島素因存在作用時間短、吸收變異大、作用峰值明顯、低血糖發生率高等諸多問題，日益被胰島素類似物取代[2]。門冬胰島素臨床用于治療糖尿病[3]，于2000年在美國批準上市[4]，其與常規胰島素相比可更快地控制血糖，對1型與2型糖尿病有良好的療效，市場前景廣闊[5-6]。與傳統的高效液相色譜（HPLC）法相比，超高效液相色譜（UPLC）法填料顆粒小、均勻，具有柱效高、分析速度快、分離度高、靈敏度好等特點[7-8]，因此被廣泛應用于生物化學、藥物研究分析等領域[9]。本研究中采用UPLC法測定門冬胰島素的含量，為提升其質量標準提供依據。

1 儀器與試藥

儀器：LC-30A型高效液相色譜儀，包括SPD檢測器（日本 Shimadzu公司）；FE20型酸度計、XS105型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

試藥：門冬胰島素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 410011-201501，效價為 27.5 U／mg）；門冬胰島素（江蘇萬邦生化醫藥集團有限責任公司，批號為E0301）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GISS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：0.2 mol／L Na2SO4溶液(取無水硫酸鈉 28 g，加水 900 mL溶解，加 85%磷酸溶液 2.7 mL，用乙醇胺調 pH 至 3.6，加水至 1 000 mL，經 0.45 μm微孔濾膜濾過，即得)-乙腈（72 ∶18，V／V，A）-50%乙腈(B)，梯度洗脫（0～10 min，65%A；10～23 min，65%A→20%A；23～25 min，20%A→65%A；25～30 min，65%A）；流速：0.25 mL／min；檢測波長：214 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

2.2 溶液制備

取門冬胰島素對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加0.01 mol／L鹽酸溶解并定容，制成質量濃度為1.0 g／L的溶液，室溫放置，使B3Asp門冬胰島素和A21Asp門冬胰島素的含量不低于1%，作為系統適用性溶液。取門冬胰島素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用0.01 mol／L鹽酸溶解并定容，制成每1 mL含 1.0 mg（約 10 U）的對照品溶液。取樣品約 10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用0.01 mol／L鹽酸溶解并定容，搖勻，即得供試品溶液。以0.01 mol／L鹽酸溶液作為陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果陰性對照品溶液色譜在與對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

圖1 超高效液相色譜圖

線性關系考察：取門冬胰島素對照品50.05 mg，置25 mL容量瓶中，用0.01 mol／L鹽酸溶液制成質量濃度分別為 0.7，0.9，1.0，1.1，1.3 g／L 的系列對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，以門冬胰島素質量濃度（X，g／L）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝ -10 468X＋36 966，R2＝0.999 99（n＝5）。結果表明，門冬胰島素質量濃度在 0.05～1.30 g／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取對照品溶液適量，按擬訂色譜條件進樣測定，平行 6次，記錄峰面積。結果的 RSD為0.02%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液適量，定容，室溫放置，分別于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的 RSD為0.18%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品6份，同法制成供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為0.02%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別量取低、中、高質量濃度的門冬胰島素對照品溶液各適量，共9份，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝9）

3 討論

本研究中建立了檢測門冬胰島素含量的UPLC法。該法的出峰時間僅為8 min，與高效液相色譜法所需的出峰時間22 min相比，時間縮短了64%，能更快速檢測門冬胰島素含量，且方法專屬性好，精密度、穩定性、重復性好，可用于測定門冬胰島素含量。