百草枯中毒大鼠肺組織ACE2/ Ang-(l-7)/Mas受體表達(dá)變化及氯沙坦的干預(yù)作用

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百草枯(Paraquat, PQ)是目前國內(nèi)廣泛應(yīng)用的除草劑，中毒后其病死率可高達(dá)90%[1]，目前尚無特異有效的PQ中毒的治療藥物，因此，針對百草枯中毒治療藥物的研究迫在眉睫。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)包括經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)/血管緊張素II(Ang II)/ 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶1型受體(AT1R)軸與新近發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)/血管緊張素(1-7)[Ang-(l-7)]/Mas受體軸，后者對前者起負(fù)向調(diào)節(jié)作用[2]。有報(bào)道，RAS與肺損傷、肺纖維化及肺動(dòng)脈高壓等多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察中毒大鼠肺組織中Ang II 及ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸的表達(dá)，并觀察血管緊張素轉(zhuǎn)化酶受體拮抗劑氯沙坦對其表達(dá)的影響，探尋百草枯中毒治療的新靶點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及標(biāo)本采集 健康雄性SD大鼠54只，體重(200±30)g，清潔級，購于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按隨機(jī)原則分為3組：對照組(N組)、染毒組(PQ組)、干預(yù)組(L組)，每組18只。 PQ組及L組：一次性腹腔注射百草枯溶液(18mg/kg)，N組以等量生理鹽水替代。L組半小時(shí)后予氯沙坦溶液(10mg/kg/d)灌胃，按實(shí)驗(yàn)時(shí)間第3天(3d)、7天(7d)、21天(21d)分為3個(gè)亞組，每亞組6只。3d、21d亞組行Micro CT掃描。第3d、7d、21d處死各亞組大鼠，完整取出肺組織，HE染色及Masson染色確定肺泡炎及肺纖維化程度，ELISA法檢測肺勻漿液中Ang II及Ang-(1-7)含量，免疫組化檢測ACE2及Mas受體蛋白表達(dá)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 20%百草枯溶液購自安徽美科達(dá)農(nóng)化有限公司，氯沙坦鉀片劑購自杭州默沙東公司， Ang-(1-7)及Ang II酶聯(lián)免疫測定試劑盒購自北京誠林生物科技公司，兔抗鼠ACE2多克隆抗體購自北京博奧森公司，Mas受體單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司。

1.3 大鼠活體肺組織Micro CT檢查 掃描參數(shù)設(shè)置：管電壓50kVp，管電流500μA，掃描模式360°，曝光時(shí)間1000ms，探測器組件模式4×4，平均幀數(shù)2，掃描時(shí)間約10min。

1.4 肺泡炎、肺纖維化程度判斷 參照Szapie等[4]的方法用HE染色確定肺泡炎的程度，Masson染色確定肺纖維的程度，均分為4級，由輕至重分別記為 0、1、2、3分。顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)變化，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)算其平均值作為最后得分。

1.5 ELISA 測定肺組織勻漿中Ang II、Ang-(1-7)含量 每組大鼠取左肺組織適量，制備肺組織勻漿，取勻漿上清，生理鹽水稀釋為10%肺組織勻漿檢測Ang II及Ang-(1-7)含量。操作按ELISA 試劑盒說明書步驟講行。

1.6 免疫組化法測定ACE2及Mas受體在肺組織中的表達(dá) 兔抗鼠ACE2多克隆抗體及Mas受體單克隆抗體以1:200稀釋。經(jīng)烤片、脫蠟、脫水、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)后加一抗，4℃冰箱孵育過夜，次日滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃冰箱孵育，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、干燥、封片。顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測出每個(gè)視野的光密度值和面積，得出其單位面積的平均光密度值(OD) 平均值表示蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 PQ組大鼠中毒后逐漸出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)、進(jìn)食及飲水減少，步態(tài)不穩(wěn)，呼吸急促，口唇發(fā)紺，體重下降，上述癥狀隨中毒時(shí)間延長逐漸明顯。L組大鼠情況有所改善，精神飲食尚可，體重下降較PQ組大鼠少。N組大鼠表現(xiàn)正常。

1.2 肺部Micro CT 影像學(xué)表現(xiàn) 大鼠俯臥位Micro CT顯示：N組大鼠雙肺紋理清晰、未見異常密度影。PQ組大鼠中毒后第3d部份肺紋理模糊，可見部份區(qū)域肺呈斑片狀密度增高影，第21d肺斑片狀高密度影范圍擴(kuò)大，可見肺纖維化及蜂窩樣改變。L組大鼠第3d及第21d上述表現(xiàn)較PQ組減輕(圖1)。

圖1 3組大鼠肺Micro CT影像學(xué)表現(xiàn)

2.3 肺組織HE染色及Masson染色 N組大鼠肺組織HE染色可見肺泡結(jié)構(gòu)正常，無充血、水腫及出血，肺泡間隔無增厚，Masson染色顯示支氣管周圍有少量藍(lán)綠色膠原纖維。PQ組大鼠3d、7d亞組中肺組織HE染色可見明顯肺泡炎癥表現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)可見水腫液，肺泡毛細(xì)血管充血、出血，肺泡間隔增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤， Masson染色可見7d亞組出現(xiàn)支氣管周圍及肺泡間隔染成藍(lán)綠色的膠原纖維，隨著時(shí)間的延長膠原纖維增加，以第21d亞組最明顯。L組大鼠上述時(shí)間點(diǎn)肺組織的病理變化與PQ組的改變相似，但病變程度較PQ組輕(圖2及圖3)。

圖2 肺組織HE染色(×100)

2.4 各組肺泡炎程度積分及肺纖維化程度積分比較 肺泡炎程度積分比較，PQ組及L組大鼠第3d、7d肺泡炎程度積分較N組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PQ組比較，L組第3d、7d的積分均減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但第21d三組積分比較無明顯差異。肺纖維化程度積分比較，PQ組及L組大鼠第7d、21d肺纖維化程度積分明顯高于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PQ組比較，L組大鼠第7d、21d肺纖維化程度積分減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

圖3 肺組織masson染色(×200)

2.5 肺組織勻漿Ang II測定結(jié)果 PQ組及L組大鼠肺組織勻漿中Ang II含量隨時(shí)間延長逐漸升高，各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于N組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但L組大鼠肺組織勻漿AngII含量較 PQ組降低，各時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.6 肺組織勻漿Ang-(1-7)測定結(jié)果 N組大鼠肺組織勻漿中Ang-(1-7)含量隨時(shí)間延長無明顯變化，各時(shí)間點(diǎn)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PQ組及L組大鼠中毒后第3d肺組織勻漿中Ang-(1-7)的含量低于N組，第7d、21d較N組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。L組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織勻漿中Ang-(1-7)的含量明顯高于PQ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表1 3組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級積分比較(±s，n=6)

表2 3組大鼠肺組織勻漿Ang II及Ang-(1-7)含量比較(pg/mL，±s，n=6)

2.7 肺組織ACE2的表達(dá)PQ組及L組大鼠ACE2蛋白在第3d、7d表達(dá)較N組弱，第21d表達(dá)較N組明顯增高 (P<0.05)。L組大鼠各時(shí)間點(diǎn)ACE2蛋白的表達(dá)均較PQ組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (圖4，表3)。

圖4 3組大鼠肺組織中ACE2蛋白的表達(dá)(×200)

2.8 肺組織Mas受體的表達(dá)PQ組及L組大鼠Mas受體在第3d、7d表達(dá)較N組弱，第21d表達(dá)較N組明顯增高 (P<0.05)；L組大鼠各時(shí)間點(diǎn)Mas受體的表達(dá)均較PQ組高 (P<0.05)(圖5，表3)。

圖5 3組大鼠肺組織中MAS受體蛋白表達(dá)(×200倍)

組別Mas受體ACE23d7d21d3d7d21dN組0.481士0.0240.482士0.0250.482士0.0230.318士0.0110.318士0.0150.313士0.017PQ組0.159士0.018▲0.297士0.027▲0.576士0.008▲0.079士0.018▲0.185士0.012▲0.372士0.018▲L組0.225士0.025▲★0.391士0.032▲★0.761士0.117▲★0.123士0.016▲★0.235士0.017▲★0.468士0.053▲★F值346.24464.54425.235410.549126.35132.231P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05 注:與同時(shí)間點(diǎn)N組比較,▲P<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)PQ組比較,★P<0.05

3 討 論

肺是PQ作用的主要靶器官，張卓一等在PQ致肺損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PQ中毒后1-3天主要表現(xiàn)為肺泡炎、肺水腫、肺出血；7-14天肺泡炎癥減輕，局部膠原纖維增生，21天后出現(xiàn)彌漫性肺纖維化[5,6]。本實(shí)驗(yàn)中，PQ中毒所致大鼠行為學(xué)、病理改變與博來霉素致大鼠肺纖維化模型的肺損傷發(fā)展過程[7]及張卓一等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致，且病理染色顯示肺泡炎評分及肺纖維化程度積分均明顯高于N組，提示百草枯中毒模型建立成功。L組大鼠使用氯沙坦灌胃干預(yù)后中毒癥狀較PQ組大鼠減輕，肺泡炎及肺纖維化程度積分均較PQ組大鼠明顯減輕，提示氯沙坦可在一定程度上減輕百草枯中毒肺損傷及肺纖維化的形成。

微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Microcomputedtomography，MicroCT)又稱微型CT、顯微CT，是一種非破壞性的3D成像技術(shù)，可在不破壞樣本的情況下清楚顯示樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，肺泡炎與肺纖維化的病理變化發(fā)展與影像學(xué)改變存在一致性[8]，較多實(shí)驗(yàn)證實(shí)MicroCT可用于肺纖維化的動(dòng)態(tài)觀察[9,10]。本實(shí)驗(yàn)采用MicroCT對PQ中毒大鼠觀察肺組織影像學(xué)變化。結(jié)果顯示中毒后大鼠出現(xiàn)不同程度的肺纖維化表現(xiàn)，肺纖維化早期主要表現(xiàn)為雙肺實(shí)變影，磨玻璃影，而結(jié)節(jié)影、胸膜下間質(zhì)增厚及蜂窩狀肺主要出現(xiàn)在中毒后期。證實(shí)了MicroCT可用于肺纖維化的無創(chuàng)診斷。

經(jīng)典RAS成員主要包括ACE、AngII及AT1R，起調(diào)節(jié)血壓、水鹽平衡及參與局部組織生長、分化的作用，并且與組織器官的纖維化有關(guān)[3]。AngII是RAS主要的效應(yīng)物質(zhì)，作用于AT1R發(fā)揮其生物學(xué)作用。ACE2/Ang-(l-7)/Mas受體軸是近年來發(fā)現(xiàn)的RAS的新成員，發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)ACE/AngII/AT1R軸的作用，如降低血壓、松弛平滑肌、抑制細(xì)胞肥大及纖維化形成。

近年發(fā)現(xiàn)，肺損傷及肺纖維化的發(fā)生發(fā)展與肺臟局部的RAS激活有密切關(guān)系。在IPF患者肺組織及PQ中毒致肺纖維化大鼠肺組織中均發(fā)現(xiàn)AngII表達(dá)明顯增多[11,12]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，PQ中毒大鼠肺組織勻漿中AngII含量增加，且隨中毒時(shí)間延長，PQ組大鼠肺纖維化程度逐漸加重，大鼠肺組織中AngII的表達(dá)逐漸增多，明顯高于N組。向氣管內(nèi)滴入ACE2拮抗劑DX600或使用ACE2特定的小干擾RNA后比單純使用博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化膠原沉積更明顯，且肺組織中AngII含量增高更明顯，而微泵注入純化的人重組ACE2后可減輕博來霉素導(dǎo)致的肺內(nèi)膠原沉積，ACE2可通過限制肺內(nèi)AngII的聚集而抑制肺纖維化的形成[11]。對各組大鼠肺組織中ACE2/Ang-(l-7)/Mas受體軸各組成部分的檢測發(fā)現(xiàn)，肺組織勻漿液中Ang-(l-7)的含量在PQ中毒大鼠第3d時(shí)明顯低于N組，但隨時(shí)間延長逐漸升高，7d后明顯高于N組，而ACE2及Mas受體的免疫組化檢測結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)第3d及第7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，PQ中毒大鼠肺組織中的表達(dá)量低于N組，而第21d高于N組，與王曉萍等[12]在PQ中毒大鼠實(shí)驗(yàn)中觀察到的ACE2mRNA表達(dá)的變化趨勢基本一致。該結(jié)果提示ACE/AngII/AT1R軸參與了肺損傷及肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。而在大鼠PQ中毒早期，肺內(nèi)ACE2/Ang-(l-7)/Mas受體軸受到抑制，而隨時(shí)間延長，肺內(nèi)ACE2/Ang-(l-7)/Mas受體軸逐漸被激活，由此結(jié)果可得出，上調(diào)ACE2/Ang-(l-7)/Mas受體軸的表達(dá)或抑制經(jīng)典RAS的表達(dá)有可能成為臨床治療PQ中毒肺損傷及肺纖維化的靶點(diǎn)。

氯沙坦是一種血管緊張素II1型受體(AT1R)拮抗劑，目前主要作為抗高血壓藥物，在肺纖維化的治療中使用較少。實(shí)驗(yàn)表明，在給予IPF患者氯沙坦治療12個(gè)月后，患者的肺功能較未治療組患者明顯好轉(zhuǎn)[13]。韓素霞等[14]在煙草煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型中觀察到氯沙坦可下調(diào)肺組織中AngII的表達(dá)，促進(jìn)ACE2蛋白的表達(dá)，從而改善肺動(dòng)脈高壓病程中肺小動(dòng)脈的重構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，PQ中毒大鼠接受氯沙坦灌胃治療后，肺組織中ACE2/Ang-(l-7)/Mas受體軸的表達(dá)較未接受氯沙坦治療的PQ中毒組增高，而肺組織中AngII表達(dá)明顯受到抑制。以上結(jié)果說明，氯沙坦可能通過抑制經(jīng)典RAS軸并上調(diào)ACE2/Ang-(l-7)/Mas受體軸的表達(dá)，從而減輕百草枯中毒肺損傷及肺纖維化的形成，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。