SHC介導的胰島素信號轉導MAPK途徑與先天性心臟病的關系

夏麗濱,石鑫，沈艷，陳艷，駱志玲

(1昆明醫科大學第二附屬醫院,昆明650101; 2云南省阜外心血管病醫院)

先天性心臟病(CHD)是人類最常見而嚴重的出生缺陷之一，是嬰幼兒非感染性疾病中主要死亡原因。活產嬰兒的CHD發生率高達6‰～8‰[1]。最常見非綜合性CHD(ns-CHD)包括房間隔缺損(ASD)和室間隔缺損(VSD)兩種類型，二者發病率分別占CHD的10%～20%和20%～30% 。Kumar等[2]實驗證實，GDM組大鼠其子鼠心臟發育異常的發生率較正常對照組明顯增高(10%vs 0)。因此胰島素或糖代謝與CHD發生是否存在某些潛在關聯，胰島素相關信號通路是否存在與心臟發育相關的信號通路相互協作和共享有待研究。2014年12月～2017年1月，本研究選取發病率最高的兩種ns-CHD類型：ASD和VSD患者的右房心肌組織，并以風濕性心臟病(RHD)二尖瓣狹窄(MS)的右心房心肌組織為對照，對比分析病例-對照的表達差異基因及信號通路變化，重點尋找與糖代謝和/或胰島素相關信號通路的變化,探索胰島素相關信號轉導與ns-CHD的發生是否享有共同的信號通路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集ns-CHD患者37例(病例組)，其中ASD 23例、VSD 14例，男12例、女25例，年齡(29.0±18.75)歲；對照RHD MS患者12例(對照組)，其中男3例、女9例，年齡(47±11.25)歲。ns-CHD、RHD根據超聲心動圖及外科手術證實結果診斷。合并心外疾病、遺傳性綜合癥、左室射血分數低于50%、冠心病、慢性肝腎功能異常、血糖、血脂異常、服用抗凝藥物者除外。本實驗符合赫爾辛基宣言要求，被招募研究參與者均知情同意，并經昆明醫科大學倫理委員會批準。

1.2 取材和標本制備 病例組與對照組均收集心臟右心房外側壁心肌組織。心房組織均在心臟停跳前快速獲取，心房組織離體后冰上迅速分割成小塊，用0.1%DEPC生理鹽水沖洗，快速裝入DEPC處理過的凍存管，置于液氮中凍存。

1.3 RNA提取和DGE測序 用于DEG分析的樣本選自上述樣本，其中ns-CHD(ASD)患者5例，年齡(25±12.4)歲；RHD MS患者2例，年齡(36.4±7.4)歲。組織液氮研磨后，用TRIzol(Invitrogen, USA)抽提RNA。總RNA利用Agilent2100生物芯片分析系統檢測合格后，根據Yue等[3]的研究，運用IlluminaTruSeq RNA樣本制備工具進行轉錄組文庫構建及DGE分析。構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質檢合格后，根據說明書步驟，用Illumina HiSeq 2000進行測序。測序儀產生的原始數據經Base Calling轉化為序列數據，去掉低質量序列、Adptor序列等，經過數據處理后進行數據分析。采用NOIseq方法[4]篩選得到樣本間的差異表達基因。并使用超幾何檢驗進行GO(Gene Ontology)功能顯著性富集分析以及KEGG Pathway顯著性富集分析[5,6]。

1.4 基因定量檢測 采用實時熒光定量PCR(RT-QPCR) 法。37例ns-CHD和12例RHD患者的mRNA用TansScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (Transgen, China)逆轉錄為cDNA。所需驗證基因定量PCR引物用Primer3[7]設計。每個樣本重復3次，以Tubulin基因的表達為內參，進行Q-PCR。定量PCR在Bio-rad CFX96 (Bio-rad, USA)上進行，循環條件如下：95 ℃預變性2 min；35個循環，溫度及時間分別為95 ℃、15 s和60 ℃、 30 s。獲得目的基因表達的Ct值(Ct值=實驗Ct值-對照Ct值)。

1.5 基因差異表達的篩選 用NOIseqmethod[4]進行ns-CHD組及RHD組的基因差異表達的篩選。篩選條件為倍數值≥2及Q值≥0.8。

1.6 DGE測序和基因定量檢測 7個樣本文庫均在Illumina平臺上進行測序，過濾了原始數據之后，在7個樣本中，80%以上的原數據皆可被映射到同源轉錄組。根據Pathway分析給出有差異表達的基因，在SHC介導的MAPK激酶系統通路上，選擇5例ns-CHD和2例RHD對比中有表達有差異的基因共16個進行基因表達驗證。

1.7 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。RT-PCR實驗的資料分析用REST軟件提供的迭代統計檢驗[8]進行病例組與對照組間的基因差異表達分析，計量數據比較符合正態分布則采用t檢驗,不符合正態分布則采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料比較釆用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DGE測序和基因定量檢測情況 對每個基因進行定量檢測，標記片段均映射到了參考序列，而僅有1 bp的錯配。映射到參考序列的多基因目標段被過濾，而其余標記段進行純化[5, 6]。

2.2 篩選的差異表達基因 得到26個顯著差異表達的基因(表1)。其中共有8個基因下調，這8個基因中編碼膠原蛋白有2個：COL3A1、COL1A1，平滑肌鈣調蛋白和錨定蛋白各1個：CNN1和ACTG2，骨骼肌鈣調蛋白TNNT1 1個及肌球蛋白的輕鏈MYL2。這6個下調的基因均與肌細胞的生成有關，另外PITX2和LTBP2兩個基因表達存在下調。在表達上調的基因中，一些免疫相關基因如HLA-DQA2變化較大(log2比值=12.39)。

2.3 GO功能富集分析及Pathway分析 GO分析可見與糖相關的胰島素信號通路MAPK途徑在病例組與對照組之間差異有統計學意義。與胰島素相關的胰島素信號通路MAPK途徑在病例組與對照組之間差異有統計學意義。Pathway分析結論相似。胰島素信號通路中SHC介導的MAPK激酶系統變化最為明顯。通路上的多個基因表達在病例組中一致下調,見圖1。

2.4 基因表達驗證 驗證在37個ns-CHD和12個RHD樣本中進行，基因信息表見表2。每個基因的擴增效率均大于0.95，Ct值與濃度的相關性R2> 0.99。獲得每個樣本每個基因的Ct值，以每個樣本中Tubulin基因表達為參照。用REST軟件提供的迭代統計檢驗[8]進行病例組與對照組之間的基因差異表達，結果見表3。通路中的6個基因PTPRF (LAR)，SHC4 (SHC)，ARAF (Raf), MAP2K2 (MEK1/2)，MKNK2 (MNK)，ELK1 (Elk1)在病例組中的表達量均明顯下調(P均<0.05)。此6個基因均位于胰島素信號通路(KEGG通路:map04910 )控制細胞增生分化的途徑上。

表1 病例組及對照組樣本差異表達基因

3 討論

CHD的病因及發病機制目前仍不明確。2007年至2011年，昆明醫科大學第一附屬醫院GDM產婦胎兒心臟畸形發生率為2.99%，較文獻報道的正常妊娠胎兒心臟畸形發生率(0.8%)高。且Wren等研究也顯示妊娠期糖尿病(GDM)新生兒的心臟異常幾率是正常妊娠的5倍。因此，我們認為胰島素或胰島素樣受體觸發的信號通路可能卷入到ns-CHD的發病過程中。

胰島素不僅可調節體內代謝，并且可作為一種生長因子促進有絲分裂。胰島信號通路中可能參與到心臟發育的通路可能有兩條，一條是通過激活PI3K途徑激活蛋白的合成。有報道稱[9]激活PI3K/Akt/mTOR信號通路能抑制心臟細胞的凋亡及改善心肌功能。但本研究中我們對比患者和對照的基因表達，未能發現PI3K上游的胰島素受體底物(IRS)表達發生變化，因此未能確定PI3K通路是否卷入ns-CHD的發生中。

注：空心箭頭方向上下分別代表基因表達上調和表達下調。

圖1CHD患者胰島素信號轉導通路基因的差異表達

另一條是通過SHC激活Ras-MAPK通路激活細胞的增生與分化。本研究我們發現，胰島素信號通路中，SHC(SHC4)及其下游的效應基因Ras-MAPK等在CHD患者心臟中表達明顯下調。因此這條通路很可能卷入ns-CHD的發生機制中。MAPK通路對心臟的發育非常重要[10]。

本研究還發現，Ras-MAPK系統的下游效應基因MKNK2和ELK1表達亦在先天性心臟病中的表達也被抑制。MKNK2為鈣依賴絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員。其被Ras-MAPK激活后能磷酸化真核生物起始因子4E (eIF4E)。eIF4E對mRNA的翻譯起始很重要，并在癌癥的發生、細胞分化中扮演重要角色[11]。而ELK1本身為一轉錄因子，其是轉錄因子Ets家族及三元復合物(TCF)亞家族中的一員。本研究中其表達明顯被抑制，病例中此基因的表達量僅為對照中的0.05倍。有報道稱此基因參與肌動蛋白細胞骨架相關基因的轉錄[12]。

表2 用于表達驗證的基因

本研究結果顯示，病例組SHC4基因表達顯著下調。其在先心病病例中的表達為對照中的0.178倍，差異有統計學意義。SHC4基因是SHC基因家族中的一員。SHC是個受體家族，其中包括SHC1(ShcA)、SHC2(ShcB)、SHC3(ShcC)、SHC4(ShcD)。ShcA偶聯抗原，細胞因子受體和Ras蛋白后能激活淋巴和骨髓細胞。在胚胎期其與MAPK系統偶聯調節心臟的發育和血管形成[13]。ShcA的表達異常可影響心肌細胞發育和導致心臟功能降低，SHC4(ShcD)于2007年在黑色素瘤細胞中被發現。在成人的神經系統和肌肉組織中有較高表達，并參與磷酸化 (MuSK)。近期有報道稱，ShcD在小鼠心肌及骨骼肌中高表達。綜合SHC現今所了解的功能及在本研究病例與對照中的差異表達，我們認為SHC4很可能卷入到先天性心臟病的發病機制中。SHC1在病例中的表達量為對照中的0.188倍，雖然其統計學上無陽性(取α= 0.05)，但我們注意到關于樣本及對照組的差異僅源于偶然[(P(H1))]的對立假設可能性僅有0.057，P(H1)非常接近α。故此基因亦有可能卷入到先天性心臟病的發病機制中。

表3 基因表達驗證結果

注：*表示實驗組樣本中的上調及下調(與對照組比較)用平均因子“表達”表示，如PTPRF在實驗組中表達下調(與對照組比較)平均因子為0.041；#表示樣本及對照組的差異僅源于偶然對立假設的可能性。

除了作為一種信號接頭分子，SHC還被認為與細胞的氧化壓力相關。SHC1基因編碼的p66Shc蛋白被認為是線粒體上與細胞色素C一起產生氧自由基(ROS)的核心原件。高糖環境可促氧自由基的生成，而ROS的堆積可能致使胰島素抵抗[14]。因此與ROS產生相關的SHC基因可能卷入到胰島素抵抗的形成中[15]。但目前GDM孕婦體內的高糖環境或氧壓力是如何對胎兒中的SHC基因表達影響仍未見報道。如能揭示他們之間的關系，也許可解釋GDM產婦其胎兒易患先心病的分子病理原因。

致使先心病患者SHC基因表達下調的因素仍未知。雖然我們發現了KEGG通路中SHC的上游調控基因PTPRF表達在ns-CHD患者中下調，與對照比較差異有統計學意義。PTPF為蛋白酪氨酸磷酸酶受體，是LAR 亞家族中的一員。LAR家族與調控胚胎發育的關鍵信號通路Wnt/β-catenin 信號通路相關[16]。在小鼠中發現在胰島素抵抗的肌肉組織中PTPRF基因超表達。但在心肌細胞中，PTPRF與SHC的直接關系仍未見報道。只在神經細胞中有報道稱PTPRF通過SHC可以促神經營養因子的生成。因此，促成在心肌細胞中SHC表達降低的上游效應分子仍有待尋找。

為確定SHC-Ras-MAPK系統的信號下調為先天性心臟病病因，我們查詢了此系統與RHD的關系。并未發現SHC基因與RHD發生相關的報道，Ras-MAPK系統與RHD相關的報道也未發現，僅發現1例報道在RHD患者心肌中MAPK下調[17]。在整個SHC-Ras-MAPK信號通路上，我們發現信號通路中的基因SOS1(SOS)和KRAS(Ras)的表達雖然在ns-CHD患者中成下調趨勢但并未成統計學陽性。這也許是由于他們的表達變化較小，用現有的樣本量無法發現統計陽性。或是SHC信號傳遞的減弱，并不依賴于這兩個基因的表達量的降低。要真正找出SHC-Ras-MAPK信號通路與nc-CHD發生的關系，補齊這缺失的一環仍非常重要。

本研究中的對照組采用了風濕性心臟病的右房組織，主要是由于正常人心房組織難于獲得。除風濕性心臟病患者外，對照心房組織還可來源于非疾病死亡正常人的心臟組織或引產的胎兒。這些對照組織各有其優勢與缺點。非疾病死亡正常人的心臟組織作為對照較好，但其較難獲得，不易湊足用于后期基因表達驗證的例數。且非疾病死亡正常人的心臟組織獲取需經歷一定死亡時間，心臟停跳時間的延長亦會影響基因表達。引產的胎兒亦是正常對照的一個來源，但引產藥物、年齡的不匹配等因素亦會影響最終分析結果。在DEG分析中，顯著下調的基因多是肌肉的組成成分，如膠原、錨定蛋白和肌球蛋白。這可能反映了先心病中心肌發育不全分子因素。而顯著上調的基因中包含HLA-DQA基因，這可能反映了風濕性心臟病發生的免疫調節異常。

綜上所述，SHC介導的MAPK通路變化可能影響心臟發育，SHC基因與胰島素抵抗可能是GDM新生兒心臟畸形患病率增加的原因之一。