頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定井礦鹽中的短鏈脂肪酸

馮峰 范廣宇 劉通 張峰

摘?要?建立了測(cè)定井礦鹽中未知異味成分的定性和定量分析方法。將具有異味的井礦鹽成品及其原料鹵水采用頂空進(jìn)樣，HP-innoWax色譜柱（ 60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）進(jìn)行分離，電子轟擊離子源進(jìn)行電離，使用掃描離子模式（Scan）對(duì)未知異味成分進(jìn)行定性分析，經(jīng)過(guò)NIST譜庫(kù)檢索和標(biāo)準(zhǔn)品雙柱確認(rèn)，在原料鹵水和異味井礦鹽成品中分別準(zhǔn)確鑒定了13種和5種短鏈脂肪酸。采用選擇離子模式（SIM），基質(zhì)匹配外標(biāo)法對(duì)井礦鹽成品進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，5種短鏈脂肪酸在0.13～5.00 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，檢出限為0.05～0.20 mg/kg。在0.25、0.50和2.50 mg/kg添加水平時(shí)，回收率范圍為82.0%～104.0 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%～9.8%（n=6）。本方法簡(jiǎn)單、靈敏，可用于井礦鹽中短鏈脂肪酸的準(zhǔn)確定性定量分析。

關(guān)鍵詞?頂空進(jìn)樣; 氣相色譜-質(zhì)譜; 井礦鹽; 短鏈脂肪酸

1?引 言

短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids， SCFAs）通常指具有1～6個(gè)碳原子碳鏈的有機(jī)酸，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸等，它們都有強(qiáng)的揮發(fā)性，也被稱為揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid， VFA）[1]。研究表明，生物體內(nèi)的短鏈脂肪酸具有降低結(jié)腸內(nèi)pH 值、抑制致病菌的繁殖、維持益生菌代謝、保持腸道菌群穩(wěn)態(tài)、抑制促炎因子產(chǎn)生、減少炎癥反應(yīng)、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡及控制原癌基因表達(dá)等作用[2，3]。然而，由于某些短鏈脂肪酸含有特殊氣味，如果食品中含有過(guò)量的短鏈脂肪酸，會(huì)影響消費(fèi)者對(duì)食品的食欲，甚至對(duì)相關(guān)產(chǎn)品產(chǎn)生恐慌。例如在2017年4月爆發(fā)的某公司生產(chǎn)的井礦鹽“臭味鹽”事件（食鹽開(kāi)袋即有濃烈的臭味），就是因?yàn)槿狈煽俊⒂行У漠愇冻煞址治鲨b定方法，未能及時(shí)識(shí)別出其中殘留的短鏈脂肪酸，導(dǎo)致消費(fèi)者恐慌。

目前，短鏈脂肪酸的測(cè)定方法[4]主要有離子色譜法[5，6]、氣相色譜法[7～10]、液相色譜法[11～13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14～16]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17]等，但這些方法主要是針對(duì)環(huán)境樣品、工業(yè)廢水、發(fā)酵產(chǎn)物和生物樣品中的若干種特定短鏈脂肪酸而展開(kāi)，而對(duì)于食品中大量短鏈脂肪酸同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的方法還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏測(cè)定井礦鹽中未知短鏈脂肪酸的分析方法，并成功應(yīng)用于臭味鹽中未知異味成分分析，在井鹽原料中共定性檢測(cè)到13種短鏈脂肪酸成分，并定量檢測(cè)了最終產(chǎn)品中殘留的5種短鏈脂肪酸。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司），配有CTC PAL頂空進(jìn)樣器和ChemStation E.02工作站; HP-innoWax毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司）; Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）; XP 105分析天平（瑞士Mettler公司）; PB-10型pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）。

乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸、戊酸、2-甲基戊酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、2-乙基丁酸、己酸和2-甲基己酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%，Dr.Ehrenstorfer公司）; NaCl（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）; 其它試劑均為分析純; 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別取乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用超純水溶解，配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取配制好的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容，配制成100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)逐級(jí)稀釋到所需濃度。

井礦鹽短鏈脂肪酸定量用標(biāo)準(zhǔn)溶液配制： 稱取8.00 g NaCl于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制0.05、0.125、0.25、0.50、2.50和5.00 mg/kg的系列加標(biāo)樣品，然后加入200 μL 0.2% H3PO4溶液，迅速密封，垂直瓶體，水平輕微振蕩使之充分混勻，待測(cè)。

2.3?樣品處理

準(zhǔn)確稱取井礦鹽樣品8.00 g于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入200 μL 0.2% H3PO4溶液，迅速密封，小心混勻，待測(cè)。

2.4?儀器方法

2.4.1?頂空進(jìn)樣條件?頂空振蕩室加熱溫度： 80℃; 加熱時(shí)間： 30 min; 加熱方式： 振蕩加熱; 頂空進(jìn)樣針溫度： 80℃; 進(jìn)樣量： 1 mL，不分流模式; 用高純氦氣推動(dòng)和清洗頂空針; 清洗時(shí)間： 0.5 min。

2.4.2?氣相色譜條件?HP-innoWax色譜柱（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）; 升溫程序： 初始溫度50℃保持1 min，以10℃/min 升至180℃，再以5℃/min升至200℃，保持2 min; 進(jìn)樣口溫度： 250℃; 傳輸線溫度： 250℃; 載氣： 高純氦，純度>99.999%; 流速： 1.0 mL/min。

2.4.3?質(zhì)譜條件?離子源： EI電離源;電子能量： 70 eV; 四極桿溫度： 150℃; 離子源溫度： 230℃; 掃描方式： 未知成分分析時(shí)使用掃描離子模式（SCAN）; 短鏈脂肪酸定量時(shí)使用選擇離子掃描模式（SIM）。

3?結(jié)果與討論

3.1?井礦鹽中異味成分的定性分析

根據(jù)食用鹽國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[18]，食用鹽應(yīng)無(wú)異味。 臭味井礦鹽可聞到臭味，推測(cè)其中的異味成分為某些揮發(fā)性成分，采用氣相色譜-質(zhì)譜的進(jìn)行了分析。考慮到井礦鹽在生產(chǎn)加工工藝中主要是通過(guò)對(duì)來(lái)自礦井中的鹵水進(jìn)行加熱處理以去除水分，加熱過(guò)程會(huì)引起揮發(fā)性成分的損失，因此，本研究首先對(duì)從臭味鹽事發(fā)公司現(xiàn)場(chǎng)采集的用于井礦鹽生產(chǎn)的鹵水使用頂空進(jìn)樣、GC-MS/SCAN 全掃描模式進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)到的所有色譜峰，使用NIST譜庫(kù)進(jìn)行初步的識(shí)別，鹵水中的揮發(fā)性成分主要是短鏈脂肪酸成分。對(duì)于檢出的這些化合物，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了鑒定，并使用極性不同的色譜柱（DB-1701）進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果共鑒定出13種短鏈脂肪酸成分。

在完成鹵水中異味成分的分析后，本研究也對(duì)開(kāi)袋有異味的井礦鹽產(chǎn)品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了識(shí)別，結(jié)果表明，井礦鹽產(chǎn)品中僅有5種短鏈脂肪酸成分（乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸）被檢出。對(duì)于檢出的這些短鏈脂肪酸，依據(jù)《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，均屬于“允許使用的食用合成香料”[17]。

3.2?井礦鹽中短鏈脂肪酸定量分析條件優(yōu)化

對(duì)于短鏈脂肪酸的定量分析，常用的色譜柱是DB-FFAP，其固定相是硝基對(duì)苯二甲酸改性的聚乙二醇（PEG）。本研究選擇了同樣以PEG為固定相的HP-innoWax色譜柱進(jìn)行分離條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，最終確定的升溫程序見(jiàn)2.4.2節(jié)，5種短鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)的定量和定性離子信息見(jiàn)表1。

在井礦鹽中，短鏈脂肪酸會(huì)以HA（游離型）和A（離子型） 兩種形式同時(shí)存在，其解離狀態(tài)受樣品pH值影響。而頂空進(jìn)樣分析是根據(jù)待測(cè)物質(zhì)在氣液平衡或者氣固液平衡時(shí)氣態(tài)中的濃度進(jìn)行定量分析，因此，選擇合適的pH值以確保短鏈脂肪酸在井礦鹽中盡量以游離態(tài)存在，可提高檢測(cè)的靈敏度。本研究首先考察了樣品直接頂空進(jìn)樣、樣品加水頂空進(jìn)樣和樣品加磷酸溶液頂空進(jìn)樣3種條件下的靈敏度，結(jié)果表明，短鏈脂肪酸加H3PO4溶液的響應(yīng)最高，直接頂空進(jìn)樣時(shí)響應(yīng)最低。推測(cè)是因?yàn)榇嬖谟谑雏}中的短鏈脂肪酸（HA）為弱酸性，在中性條件下處于A狀態(tài)，與食鹽中的Na+等相結(jié)合，揮發(fā)性變差; 當(dāng)加入H3PO4后，離子形式存在的短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為分子形式揮發(fā)出來(lái)，使得響應(yīng)增高。 考慮到H3PO4不易揮發(fā)，不同于HCl、HNO3等具有揮發(fā)性，可避免對(duì)樣品檢測(cè)的影響， 因此采用H3PO4溶液調(diào)整pH值。

H3PO4的加入量對(duì)整個(gè)體系的pH值有重要影響，過(guò)低的pH值甚至?xí)鹗雏}中的Cl轉(zhuǎn)化成HCl而揮發(fā)出來(lái)，從而影響檢測(cè)，并降低色譜柱使用壽命。本研究進(jìn)一步考察了H3PO4加入量對(duì)短鏈脂肪酸檢測(cè)靈敏度的影響，在5種短鏈脂肪酸的濃度均為1.25 mg/kg的加標(biāo)樣品中，分別添加0、0.2、0.5、1.0和5.0 mL 的0.2%（V/V）H3PO4，然后進(jìn)行檢測(cè)。5種短鏈脂肪酸的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度，當(dāng)不添加H3PO4溶液時(shí)，響應(yīng)值較低，當(dāng)加入0.2 mL短鏈脂肪酸后，響應(yīng)值即達(dá)最高值，隨著H3PO4加入量增加，信號(hào)強(qiáng)度又呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。因此，最終選擇加入0.2 mL 0.2%（V/V）H3PO4。

3.3?井礦鹽中短鏈脂肪酸定量分析方法學(xué)考察

在優(yōu)化的分析條件下，采用在NaCl中添加不同量的短鏈脂肪酸混和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用建立的頂空進(jìn)樣、氣相色譜質(zhì)譜方法進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行井礦鹽中短鏈脂肪酸檢測(cè)的方法學(xué)考察。5種短鏈脂肪酸在0.125～5.00 mg/kg濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限（ S/N≥3）結(jié)果見(jiàn)表2。在空白井礦鹽樣品中對(duì)每種短鏈脂肪酸各設(shè)定3個(gè)不同添加水平，每個(gè)添加濃度重復(fù)進(jìn)行6 次實(shí)驗(yàn)，測(cè)定回收率。結(jié)果表明，本方法的回收率在82%～104 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%～9.8%（n=6）。

3.4?實(shí)際樣品分析采用本方法對(duì)于從市場(chǎng)上隨機(jī)采購(gòu)的包括井礦鹽、湖鹽、海鹽等類(lèi)型無(wú)異味食鹽樣品30份，與在“臭味鹽”事發(fā)公司現(xiàn)場(chǎng)收集到的臭味鹽進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，無(wú)異味的食鹽樣品中均未有短鏈脂肪酸成分檢出，有“臭味”的井礦鹽中的丙酸含量大于3 mg/kg，丁酸、異戊酸含量大于1 mg/kg，乙酸、戊酸2種短鏈脂肪酸有檢出但低于線性范圍下限，“臭味鹽”臭味的濃淡與檢出的短鏈脂肪酸的含量相關(guān)。這些檢出的短鏈脂肪酸，盡管均已列入我國(guó)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[19]，可以在食品中使用，但相關(guān)食鹽樣品產(chǎn)生的“臭味”，不符合食用鹽國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[18]中的感官要求，應(yīng)予以消除。

4?結(jié) 論

建立了一種可同時(shí)定性定量分析井礦鹽中未知異味成分的快速、準(zhǔn)確和靈敏的頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜分析方法。將本方法用于異味井礦鹽的分析結(jié)果表明，這些異味成分均為短鏈脂肪酸，在市售無(wú)異味的食鹽中未有短鏈脂肪酸檢出。本方法也可用于其它食品中短鏈脂肪酸的檢測(cè)。

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