基于RSM模型的堿性磷酸酶參考方法測量條件研究

劉春龍 錢 全 王 勇 李申龍 徐元勇△

近年來國際檢驗醫學溯源聯合委員會(JCTLM)和衛計委臨床檢驗中心一直致力于檢驗醫學的標準化研究,希望能夠實現不同醫院檢驗結果的互認和統一[1]。但酶的測定結果往往非常混亂,同一標本在不同實驗室的數據結果 相差很大[2]。國際臨床化學和實驗室醫學聯盟(IFCC)在1986年完成了堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的推薦參考方法[3]。由于酶學參考測量存在諸多的影響因子,ALP參考方法的測量條件需要由參考實驗室在不違背參考方法既定要求的前提下進行優化。考慮響應面法(response surface methodology,RSM)不僅考慮各種影響因子對測量曲線的線性影響,也同時考慮不同因子間的交互影響和曲率影響[4]。本文基于RSM模型研究ALP參考方法的測量條件,現報道如下。

材料與方法

1.實驗材料

(1)樣本

收集北京航天總醫院檢驗科血清樣本,考慮溶血、黃疸、乳糜樣本會影響正確度驗證結果[5],本研究通過檢驗報告結果及肉眼觀察,剔除溶血、黃疸、乳糜的樣本,根據常規檢驗結果將血清進行混合,制備成符合所需濃度范圍要求的混合血清。以3000r/min的轉速離心處理,用0.2μm濾膜過濾后,分裝凍存于-80℃低溫冰箱。

ALP參考物質選用日本臨床實驗室標準委員會的CRM-001c(靶值為425U/L,擴展不確定度為3.06%,k=2)。

(2)主要儀器

Cary-100紫外、可見分光光度計(美國安捷倫公司)、XSE205十萬分位電子天平(瑞士梅特勒-托利多國際股份有限公司)、MICROLAB500稀釋配液儀(瑞士哈密爾頓公司)、HH-4恒溫水浴箱(中國國華電器有限公司)、F1523手持式鉑電阻溫度計(美國福祿克電子儀器儀表公司)。

(3)主要試劑

N-β-羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA,批號MKBD2551)、七水硫酸鋅(批號62150)、醋酸鎂(批號40680),購自美國西格瑪公司;2-氨基-2甲基-1-丙醇(AMP,批號130517A)、磷酸對硝基苯酚(4-NPP,批號130708A),購自中國阿匹斯公司。

2.方法

(1)單因素實驗

結合ALP項目參考測量原理,初步確定影響因子[6]。繪制不同影響因子與酶催化活性濃度測量結果的趨勢關系圖,確定各影響因子是否為重要影響因子,并觀察趨勢圖是否包含最高值[7],以判斷是否能確定RSM實驗區域。

(2)RSM實驗

按單因素實驗結果,確定三個重要影響因子及實驗區域,實驗區域包括高、中、低三個濃度水平(三因子三水平)。采用Box-Behnken實驗設計并按設計方案配制試劑,測量相同混合血清樣本;繪制不同影響因子與測量結果的等值線圖和響應曲面圖。

(3)驗證實驗

測量ALP參考物質CRM-001c,若測量結果符合其測量不確定度要求,則驗證通過。

(4)統計分析方法

①單因素實驗采用Minitab 16軟件進行單因素方差分析,判斷影響因子對ALP催化活性濃度的影響在不同濃度組間是否具有統計學意義。②RSM實驗采用Minitab16軟件先分別進行RSM圖形分析(等值線圖與曲面圖)、RSM模型顯著性分析、RSM模型方差分析、測量結果回歸系數估計,建立模型方程式后再使用優化器功能確定最佳測量條件。③計算正確度驗證實驗測量結果與參考物質靶值的相對偏移,再判斷其是否符合參考物質的測量不確定度要求。

結 果

1.單因素實驗結果

影響因子不同水平設計,見表1。

2.單因素分析

進行單因素方差分析,結果表明反應液pH值、4-NPP濃度、AMP濃度三個因子對ALP酶催化活性濃度的影響在不同組間具有統計學意義(P=1.14×10-9<0.01),因此所選定的三個影響因子均為重要影響因子。繪制趨勢圖(圖1),可見單因素實驗所確定實驗區域可包括ALP最高催化活性。因此可將水平3設置為RSM設計中心點[8]。

表1 影響因子不同水平設計

圖1 影響因子與其催化活性濃度結果的趨勢圖

3.RSM實驗結果

(1)Box-Behnken設計及催化活性濃度測量結果,見表2。

表2 Box-Behnken設計測量結果

(2)ALP項目RSM圖形分析,見圖2～圖4。

從圖形可以看出,ALP測量結果與各影響因子間都存在響應曲面,4-NPP濃度和AMP濃度與測量結果的等值線圖軸線與坐標軸存在明顯的角度,說明4-NPP濃度和AMP濃度之間存在明顯的交互作用,其他影響因子之間不存在交互作用。另外,pH值均處于等值線橢圓形的短徑處,即測量結果的變化對pH值最為敏感。在ALP試劑配制時,應嚴格控制反應液pH值。

(3)RSM模型方差分析,見表3。結果顯示所有重要影響因子對測量結果的影響有統計學意義(P<0.01),模型擬合效果良好(失擬項P>0.05),模型R2=94.36%和調整R2=95.99%,表明模型擬合效果良好。

表3 RSM模型方差分析

(4)測量結果回歸系數估計,見表4。

分別用Y表示ALP測量結果,A表示反應液pH值,B表示4-NPP濃度,C表示AMP濃度。

ALP各影響因子的一次效應和二次效應對ALP測量結果均存在顯著影響(P<0.01),4-NPP濃度和AMP濃度之間存在顯著交互作用(P<0.05),其他影響因子之間不存在明顯交互作用(P>0.05)。

圖2 ALP測量結果與4-NPP濃度,pH值的等值線圖和曲面圖

圖3 ALP測量結果與AMP濃度,pH值的等值線圖和曲面圖

圖4 ALP測量結果與AMP濃度,4-NPP濃度的等值線圖和曲面圖

表4 測量結果的回歸系數估計

(5)測量條件優化

使用Minitab 16軟件中的RSM模型優化器功能,選擇“望大”分析,即選擇混合血清測值最高時的測量條件。預測結果復合合意性均大于0.99,預測結果見圖5,[]內數字表示預測最佳測量條件,即ALP理論最佳測量條件為反應液pH值10.24、4-NPP濃度15.83mmol/L、AMP濃度747.28mmol/L。

(6)正確度驗證結果見表5。

表5 正確度驗證結果

討 論

檢驗醫學的標準化和一致化研究,是檢驗醫學領域的熱門話題,國內于2012年已初步建立了國家酶學參考實驗室網絡[9]。目前市場上ALP項目的測量結果與參考方法測量結果相對偏移可達8%～10%[10]。在ALP參考方法運行的過程中,必須對測量條件進行摸索和優化,以期找到最佳測量條件組合。傳統的單因素法篩選出來的測量條件之間往往會存在一定的交互作用,實驗量很大且不能得到滿意的結果。而RSM是一種多因素分析方法,能夠很好地反應測量條件之間的交互作用,且能通過選擇合理的設計方式,大幅度減少實驗次數,有效彌補單因素法的不足[4]。本研究并未完全摒棄傳統的單因素法,而是將其用于重要影響因子和RSM實驗區域的確認,創新性地將傳統的單因素法與RSM聯合起來,獲得了良好的效果。

單因素分析的結果表明反應液pH值、4-NPP濃度、AMP濃度為ALP項目的重要影響因子。分析ALP重要影響因子與催化活性濃度測量結果的趨勢圖,發現單因素分析結果均包括了測量結果最高值,因此,將中等水平即水平3設置為RSM設計的中心點。RSM常用的三種設計方式中,3k因子設計由于實驗次數較多,一般較少使用,常用Box-Behnken設計或CCD設計[12]。在本研究中,根據酶學測量的報道[7],考慮其響應曲面是存在的,Box-Behnken設計可對一階或二階系數提供更好的估計,因此選擇Box-Behnken設計。按Box-Behnken設計方案組合安排實驗,以測量結果作為RSM的響應值建立模型并繪制等值線圖和響應面圖,證明曲面確實存在,且包含最佳測量條件。對所建立的RSM模型的性能評價,主要考慮了模型的擬合度和預測準確度。RSM模型的評價結果表明,所有重要影響因子對測量結果的影響有顯著統計學意義(P<0.01),模型擬合效果良好(失擬項P>0.05),模型預測效果良好。各影響因子的一次效應和二次效應對ALP催化活性濃度測量結果存在顯著影響(P<0.01)[7]。其中,4-NPP濃度和AMP濃度之間存在顯著交互作用(P<0.05),其他影響因子之間不存在明顯交互作用(P>0.05)。交互作用的分析結果與RSM等值線圖分析結果一致。通過Minitab16軟件優化器功能,獲得了ALP最佳理論實驗條件,并通過了正確度驗證。正確度驗證結果表明,驗證結果與CRM靶值相對偏移能滿足其測量不確定度的要求。另外,通過RSM圖形分析發現,反應液pH值對ALP催化活性濃度測量結果影響較大,在試劑配制過程中,應嚴格控制。

本研究成功將RSM模型應用于ALP參考方法測量條件的研究,獲得良好的效果,探索了不同影響因子與參考測量結果的關聯性及影響因子之間的交互作用,進而為ALP檢驗項目標準化提供了科學依據。