4種維生素對黑木耳鎖狀聯合菌絲形成的影響

董錫文，朱德旋，杜春梅*，姜忠元，韓 笑，張 宇

(1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.佳木斯大學應用微生物研究所，黑龍江佳木斯 154007；3.佳木斯大學教育科學學院，黑龍江佳木斯 154007)

黑木耳[Aurieuzariaauricular(L.ex Hook.)Uzderw.]是世界上最早實現人工栽培的食用菌，其食用和藥用價值極高，深受消費者的普遍歡迎[1]。關于黑木耳生長研究已有很多[2-6]。有關黑木耳鎖狀聯合形成的研究也逐漸受到重視[7-8]，形成鎖狀聯合的菌絲再形成耳基的比例為100%，而不形成鎖狀聯合的菌絲形成耳基的比例僅為20%左右，且形成鎖狀聯合的菌絲形成耳基的時間比不形成鎖狀聯合的菌絲形成耳基的時間提前30 d左右。這說明形成鎖狀聯合的菌絲在形成黑木耳產量和降低生產成本方面具有重要影響，研究維生素對黑木耳鎖狀聯合菌絲形成的影響將會對實際生產，尤其是生產效益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株。黑木耳黑29購于黑龍江省微生物研究所。

1.1.2試劑。維生素B1片(山東仁和堂藥業有限公司)；維生素B2片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)；維生素B12片(上海信誼九福藥業有限公司)；維生素C片(山西國潤制藥有限公司)；葡萄糖(分析純，天津市北方天醫化學試劑廠)；瓊脂粉(生物試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司)。

1.1.3培養基。基礎培養基(PDA培養基)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 6.0。維生素培養基：在基礎培養基中加入不同濃度維生素，包括VB1培養基、VB2培養基、VB12培養基和VC培養基，pH 6.0。

1.1.4主要儀器與設備。MP1002電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；恒溫培養箱(上海福瑪實驗設備有限公司)；光學顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)；移液槍(Thermo Scientific公司)。

1.2試驗方法

1.2.1維生素母液的配制。將4種維生素制備成適當濃度的母液，用45 μm細菌濾膜進行過濾除菌，4 ℃冰箱儲存備用。

1.2.2培養基的制備。基礎培養基按照常規方法進行。維生素培養基采用基本培養基加維生素法，用移液槍吸取不同體積的4種維生素母液加入到基本培養基中，混勻倒平板，每種維生素終濃度分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 μg/mL。

1.2.3菌種活化與擴大培養。在25 ℃恒溫培養箱中對黑29進行活化培養4 h后，在無菌條件下用接種鏟將斜面菌種轉接至基礎培養基上進行擴大培養，待長勢良好后進行后續試驗。

1.2.4單因素試驗。在擴大培養的黑29菌落周邊選取直徑0.86 cm健壯菌絲塊，接種至維生素培養基平板中央，在距接種塊2 cm處以45°角進行插片處理，每個平板插3個蓋玻片。每個變量設3個重復，以無維生素的基本培養基為空白對照。

1.2.5正交試驗。根據單因素試驗結果，選取最佳的3個維生素濃度，采用L9(34)正交試驗因素水平表對黑29鎖狀聯合菌絲形成所需維生素含量進行優化試驗，每個組合設3個平行。

1.3測定項目與方法待黑29菌絲長滿蓋玻片，置于10×40倍顯微鏡下觀察記錄菌絲數、鎖狀聯合菌絲數并計算鎖狀聯合菌絲比率。鎖狀聯合菌絲比率=鎖狀聯合菌絲數/菌絲數×100%。

1.4數據分析試驗數據采用SPSS 17.0和Excel進行統計分析與做圖。

2 結果與分析

2.1單因素試驗結果從圖1可以看出，在試驗濃度范圍內，隨著4種維生素濃度的升高，黑29鎖狀聯合菌絲平均比率先升高后降低。當VB1和VB12濃度分別為0.25和0.15 μg/mL時，鎖狀聯合菌絲平均比率最高分別為76.33%和80.97%，比對照菌株分別提高了37.04%和45.37%。VC培養基對鎖狀聯合菌絲平均比率影響最大，當VC濃度為0.15 μg/mL時，該比率高達90.60%，比對照菌株提高了62.66%；VB2培養基對該比率影響最小，當VB2濃度為0.20 μg/mL時，該比率為67.83%，比對照菌株提高了近21.78%。因此，單因素試驗中可以確定不同維生素的最佳濃度。即VB1濃度為0.25 μg/mL、VB2濃度為0.20 μg/mL、VB12和VC濃度為0.15 μg/mL。

圖1 不同種類濃度維生素對黑29鎖狀聯合菌絲比率的影響Fig.1 The effect of different kinds and concentrations vitamin on ratios of hyphal clamp connection in H29

2.2正交試驗結果將單因素試驗最佳結果應用于正交試驗，維生素濃度正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2。從表2可以看出，影響黑29鎖狀聯合菌絲比率的主次因素依次是D、A、B、C，即VC是主要影響因子，VB1、VB2和VB12次之。方差分析結果表明，僅有D因素即VC在α=0.05水平上對鎖狀聯合菌絲比率的影響存在顯著差異，因此，在黑木耳菌絲生長培養基中首先考慮的是添加VC。經驗證試驗后等綜合方面考慮，維生素的添加最佳方案為D3A3B2C1，即VC0.18 μg/mL、VB10.28 μg/mL、VB20.20 μg/mL、VB120.12 μg/mL。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果

注：同列不同小寫字母表示不同組合間差異顯著(P<0.05)

Note：Different lowercases in the same column stand for significant differences between different combinations at 0.05 level

3 結論與討論

黑木耳菌絲的生長需要大量的碳源和氮源，不同碳源和氮源對菌絲生長有一定的影響[9-10]。趙萍[5]研究表明，適宜濃度的氨基酸(除酪氨酸)對黑木耳菌絲生長有促進作用，高濃度有抑制作用。而作為生長因子的維生素對黑木耳菌絲形成鎖狀聯合的研究很少。該研究發現，適宜濃度的VB1、VB2、VB12和VC對黑木耳菌絲形成鎖狀聯合均有促進作用，這也是生長因子促進菌絲生長的一個重要表現，與其他研究者關于維生素對食用菌菌絲生長影響的研究結果一致[11-13]。

通過正交試驗可以看出，多生長因子的加入對黑木耳鎖狀聯合形成有促進作用，鎖狀聯合菌絲比率達94.43%，高于單因子的作用，但作用效果不同。方差分析結果表明，在多因子作用中，只有VC作用效果顯著，VB1、VB2、VB12的效果未達到顯著水平，多種維生素加入的組合是VB10.28 μg/mL、VB20.20 μg/mL、VB120.12 μg/mL、VC0.18 μg/mL。因此，在黑木耳菌種制備過程中有必要考慮加入適量的維生素，以利于提高黑木耳子實體的產量。