外周血HMGB1水平與不明原因復發性流產患者Th17/Treg平衡的關系

陶曉玲 熊俊 陽艷 方敏 李蕓蕓

[摘要] 目的 探討外周血中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）水平與不明原因復發性流產患者輔助性T細胞17（Th17）/調節性T（Treg）細胞平衡的關系。 方法 選擇2016年1月～2018年1月在湖北省婦幼保健院（以下簡稱“我院”）進行治療的不明原因復發性流產患者83例為觀察組，選擇同期在我院進行產前檢查的健康孕婦80名為對照組。入院后采集兩組受試者的空腹靜脈血，采用流式細胞儀檢測其Th17、Treg細胞水平，并進行組間比較。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測兩組受試者的HMGB1、晚期糖基化終產物受體（RAGE）、白細胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-17、轉化生長因子-β（TGF-β）水平。并探討HMGB1與各細胞及細胞因子表達的相關性。 結果 觀察組HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于對照組，其Treg水平低于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。觀察組IL-6、IL-17水平高于對照組，IL-10、TGF-β水平低于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。Pearson相關性分析顯示，HMGB1與Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相關（r = 0.456、0.489、0.528、0.397、0.438，均P < 0.05），與Treg、IL-10、TGF-β水平呈負相關（r = -0.552、-0.523、-0.439，均P < 0.05）。 結論 不明原因復發性流產患者的外周血中HMGB1水平與Th17/Treg平衡間有一定的相關性，HMGB1、Th17、Treg的異常表達及Th17/Treg失衡可能參與了不明原因復發性流產的發生。

[關鍵詞] 高遷移率族蛋白B1;復發性流產;Th17/Treg細胞;相關性

[中圖分類號] R714.21? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（c）-0094-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the high mobility group box protein B1 （HMGB1） level in peripheral blood and the helper T cell 17 （Th17）/regulatory T （Treg） cell balance in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion. Methods From January 2016 to January 2018， 83 patients with unexplained recurrent abortion who were treated in Hubei Maternal and Child Health Hospital （"our hospital" for short） were selected as the observation group， and 80 healthy pregnant women who underwent prenatal examination in our hospital during the same period were selected as the control group. Fasting venous blood was collected after admission. Th17 and Treg cell levels were measured by flow cytometry and compared between the two groups. The levels of Th17 and Treg cells were detected by flow cytometry and compared between groups. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of HMGB1， advanced glycation end product receptor （RAGE）， interleukin-6 （IL-6）， IL-10， IL-17， and transforming growth factor-β （TGF-β）. The relationship between HMGB1 and the expression of various cells and cytokines was also investigated. Results The levels of HMGB1， RAGE， Th17 and Th17/Treg in the observation group were higher than those in the control group， and the Treg was lower than that in the control group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The levels of IL-6 and IL-17 in the observation group were higher than those in the control group， and the levels of IL-10 and TGF-β were lower than those in the control group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Pearson correlation analysis showed that HMGB1 was positively correlated with Th17， Th17/Treg， RAGE， IL-6， IL-17 levels （r = 0.456， 0.489， 0.528， 0.397， 0.438， P < 0.05）. There was a negative correlation between the levels of HMGB1 and Treg， IL-10 and TGF-β （r = -0.552， -0.523， -0.439， P < 0.05）. Conclusion There is a certain correlation between HMGB1 level and Th17/Treg balance in peripheral blood of patients with unexplained recurrent abortion. The abnormal expression of HMGB1， Th17 and Treg and the imbalance of Th17/Treg may be involved in the occurrence of unexplained recurrent abortion.

[Key words] High mobility group chromosal protein B1; Recurrent spontaneous abortion; Th17/Treg cell; Correlation

復發性流產是指孕婦在妊娠過程中出現連續3次及3次以上次數的自然流產，其發生的原因多數與患者自身的內分泌紊亂、感染因素、遺傳因素、生殖器官的解剖學形態異常等有關。而在復發性流產中約有30%～50%患者的發病原因仍不明確，臨床上將此類流產稱為不明原因復發性流產[1]。隨著研究的不斷深入，此類不明原因的復發性流產的發生機制的研究取得了一定的進展，主要認為是孕婦在妊娠早期時母體對胎兒產生的免疫反應導致，其中表現最為顯著為輔助性T細胞17（Th17）、調節性T細胞（Treg）在母體對胎兒間的相互作用導致免疫耐受、免疫排斥反應的發生，Th17、Treg細胞的水平異常及比例的失衡是主要的病理機制[2-3]。外周血高遷移率族蛋白B1（high mobility group chromosal protein B1，HMGB1）、晚期糖基化終產物受體（advanced glycation end product receptor，RAGE）是一種作用較強的免疫炎性反應因子，可參與機體內一系列炎性反應的發生和進展，并加重機體的炎性反應[4-5]。既往的報道顯示[6-7]，HMGB1、RAGE水平在病理性妊娠患者中有顯著的變化，提示HMGB1、RAGE可能參與了患者的異常妊娠過程。因此，本研究中通過對不明原因復發性流產婦女的HMGB1、RAGE、Th17、Treg及相關細胞因子的檢測分析，探討HMGB1與Th17/Treg平衡間的關系，以期為不明原因復發性流產的機制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月～2018年1月在湖北省婦幼保健院（以下簡稱“我院”）進行治療的不明復發性流產患者83例作為觀察組，年齡21～35歲，平均（27.72±5.42）歲，孕齡6～20周，平均（14.33±3.86）周。納入標準：①經診斷確診為不明復發性流產，有3次及以上次數的自然流產史;②未發現自然流產的相關病因;③精神狀態正常，能夠配合研究過程的進行。排除標準：①自然流產有明確的病因;②并發全身惡性腫瘤疾病、自身免疫性疾病等影響本研究各項指標水平的判斷。選擇同期在我院進行產前檢查的健康孕婦80名作為對照組，年齡20～38歲，平均（29.08±5.79）歲，孕齡7～19周，平均（13.76±3.37）周。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標及檢查方法

統計兩組的HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg等指標，并比較兩組受試者的Th17相關細胞因子IL-6、IL-17和Treg相關細胞因子IL-10、TGF-β水平。

入院后，采集兩組受試者空腹靜脈血約5 mL，加入到抗凝管中，經Ficoll密度梯度離心機（德國Sigma）離心，分離得到外周血的單細胞，并制備成細胞混懸液，采用Attune NxT流式細胞儀（美國賽默飛世爾科技公司）檢測Th17、Treg細胞，并計算Th17/Treg比例。血液樣本經TGL-16K高速離心機（上海安亭科學儀器廠）離心分離，得到血清，采用酶聯免疫吸附法檢測HMGB1、RAGE、白細胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-17、轉化生長因子-β（TGF-β），相關檢測試劑盒均購自美國R&D公司，操作步驟嚴格按說明書要求進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗;采用Pearson檢驗進行相關性分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較

觀察組HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于對照組，Treg水平低于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 兩組患者IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β水平比較

觀察組患者的IL-6、IL-17水平高于對照組，IL-10、TGF-β水平低于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 HMGB1與各指標相關性分析

Pearson相關性分析顯示，HMGB1與Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相關（r = 0.456、0.489、0.528、0.397、0.438，均P < 0.05），與Treg、IL-10、TGF-β水平呈負相關（r = -0.552、-0.523、-0.439，均P < 0.05）。

3 討論

近年來，復發性流產患者呈逐漸增多的趨勢，其中有較高比例的患者均為不明原因的自發性流產，嚴重威脅廣大的妊娠期孕婦的生命健康和生活質量，不利于患者正常的妊娠分娩過程的完成。隨著發病率的增加，臨床對其關注度不斷提高，并不斷深入探討其自發流產病因，其中患者自身的免疫學因素與復發性流產病理機制間的關系頗受臨床研究者的關注[8-9]。母體與胚胎直接接觸的組織部位在臨床上被稱為母胎界面，正常妊娠的孕婦的母胎界面存在著一定數量的免疫細胞，通常情況下，這些免疫細胞的存在及適宜比例的分布可形成特有的免疫耐受狀態，有利于妊娠并保護胎兒正常分娩過程的進行[10]。但是在某些病理因素的影響下，母胎界面的免疫細胞數量和功能發生改變，如各種炎性細胞因子水平的增加，調節并作用于患者自身的固有免疫反應，增加了妊娠期孕婦感染、自身免疫性疾病、排斥反應的發生概率，不利于孕婦妊娠過程中子宮胚胎的發育及營養的供給，增加了孕婦母體對胚胎的免疫排斥反應，從而導致妊娠的失敗，出現復發性的流產[11-12]。HMGB1是一種能夠參與機體組織細胞的DNA復制、轉錄、重組及修復過程的DNA伴侶性蛋白。多項研究[13-14]報道證實，HMGB1參與了患者的免疫炎性反應，并且在病理性妊娠患者中檢測到HMGB1、RAGE水平的異常表達。在炎性反應的刺激下，HMGB1、RAGE等水平的異常增高表達，使得高濃度的HMGB1、RAGE暴露在母胎界面，從而引起免疫功能的失調，繼而導致復發性流產的發生[15]。因此，探討HMGB1與Th17/Treg平衡間的相關性，可為不明原因復發性流產的治療提供幫助。

本研究通過比較復發性流產患者和正常妊娠孕婦的各項指標，發現觀察組患者的HMGB1、RAGE、Th17、Th17/Treg水平高于對照組，Treg水平低于對照組。在相關細胞因子水平的比較中，觀察組患者的IL-6、IL-17水平高于對照組，IL-10、TGF-β水平低于對照組，提示在不明原因復發性流產患者外周血中的HMGB1、RAGE、Th17、Treg、Th17/Treg及相關細胞因子水平IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β與正常孕婦相比發生了顯著的變化。另外，患者體內的Th17過度表達，會抑制Treg細胞表達，從而使復發性流產孕婦體內出現過度免疫耐受，從而證實了復發性流產的出現與Th17與Treg細胞表達異常及比例的失衡有關[16-17]。復發性流產患者的HMGB1、RAGE水平明顯升高，表明此類患者體內出現了炎性反應，導致患者母胎界面的免疫功能的失調。本研究中HMGB1與Th17、Th17/Treg、RAGE、IL-6、IL-17水平呈正相關，與Treg、IL-10、TGF-β水平呈負相關，進一步證明了HMGB1參與了復發性流產患者的Th17/Treg平衡的調節[18-19]。分析其原因，HMGB1通過作用于Th17細胞促進炎性細胞因子的釋放，從而使得Th17細胞及相關炎性細胞因子IL-6、IL-17水平隨著HMGB1的增加而增加，且呈正相關。HMGB1通過作用于Treg細胞而參與免疫抑制因子的調控，使得Treg及其相關細胞因子IL-10、TGF-β水平隨著HMGB1的增加而減少，且呈負相關性。HMGB1通過對患者Th17和Treg兩個方面的調節，使患者的Th17/Treg比例平衡被打破[20-21]。HMGB1與RAGE呈正相關，這是因為HMGB1的高表達可誘導RAGE水平的增加，HMGB1可與患者的RAGE受體結合，直接參與機體的免疫炎性反應。

綜上所述，不明原因復發性流產患者的外周血HMGB1、RAGE水平會顯著升高，Th17細胞、Th17/Treg及相關細胞因子水平IL-6、IL-17水平顯著增加，而Treg細胞及相關細胞因子IL-10、TGF-β水平則顯著降低。提示HMGB1、Th17、Treg的異常表達及Th17/Treg失衡可能參與了不明原因復發性流產的發生。

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（收稿日期：2018-08-07? 本文編輯：王? ?蕾）