乏氧和低糖條件下低表達ESE3促進胰腺癌細胞的侵襲

肖笛，趙天鎖，俞鳴△

胰腺癌是世界范圍內第4大惡性消化道腫瘤，5年總體生存率不足7%［1］。究其原因，是由于絕大部分胰腺癌患者發生了淋巴結和/或遠端器官轉移［2］。上皮特異性ETS 轉錄因子3（ESE3）定位于染色體11p12，在上皮細胞中特異性地表達［3］。目前，在多種惡性腫瘤中，ESE3 均被認為是抑癌基因，其同時作為核轉錄因子，可以特異地識別GGAA/T序列，調控下游靶基因的表達，在惡性腫瘤的發生發展中發揮著重要功能［4］。胰腺癌實體腫瘤常處于乏氧微環境中，有文獻報道胰腺癌亦處于低糖微環境之中［5］。但是胰腺癌細胞ESE3 表達水平在乏氧和低糖壓力刺激下的變化目前尚鮮見報道。本研究旨在探討乏氧和低糖微環境中ESE3對胰腺癌細胞侵襲的影響，為胰腺癌的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 患者標本 收集2005年1月—2014年10月在天津醫科大學腫瘤醫院經組織病理學診斷為胰腺導管腺癌（PDAC）且接受根治性手術切除的腫瘤組織標本99例，其中包含鄰近正常胰腺組織標本16例。所有患者術前均未經化療或放療，隨訪至2017年1月。本研究經天津醫科大學腫瘤醫院倫理道德委員會批準。

1.1.2 細胞與試劑 人胰腺癌細胞株PANC-1、SW1990由天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所保存。常規DMEM培養基、低糖DMEM 培養基和胎牛血清均購于Gibco（美國）公司；ESE3 及其空白對照慢病毒購于上海吉瑪基因；嘌呤霉素購于InvivoGen 公司（美國）；基質膠購自BD Bioscience（美國）；Transwell 小室購自Corning公司（美國）；核-漿分離試劑盒與BCA 蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher Scientific（美國）；兔抗人ESE3多克隆抗體購自LifeSpan BioSciences（美國）；免疫組化試劑盒、鼠抗人HIF-1α 單克隆抗體和兔抗人GRP78 多克隆抗體購自Abcam 公司（英國）；鼠抗人β-antin、β-Tublin和Lamin B1 單克隆抗體以及兔抗人α-Tublin 多克隆抗體購自武漢三鷹公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化分析ESE3表達水平及判定方法 按照免疫組化試劑盒說明書將入組的99例標本的組織芯片經脫蠟、梯度乙醇水化、蒸餾水以及抗原修復后，加50μL 的ESE3 抗體（1∶200稀釋），4 ℃過夜孵育后滴加二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色后光鏡下觀察表達水平。根據ESE3陽性細胞染色強度和百分比進行半定量評分。染色強度評分為0（陰性）、1（低）、2（中）、3（高）。陽性細胞百分比評分為0（無染色）、1（1%～25%染色）、2（26%～50%染色）、3（51%～100%染色）。最終染色評分通過強度評分×面積評分來確定，范圍0～9。最終評分低于5被認為陰性或低表達，5～9被認為中高表達。

1.2.2 TCGA 數據庫驗證腫瘤轉移和腫瘤大小與ESE3 mRNA 表達水平的關系 選取TCGA 數據庫（http://www.cbioportal.org/）中147例PDAC 患者的臨床資料，并對患者ESE3 mRNA 表達水平進行歸一化處理［6］，按照有無淋巴結和/或器官轉移，分為轉移組和非轉移組；同時以3 cm為截斷值［7］將PDAC 患者分為腫瘤≥3 cm 組和腫瘤＜3 cm 組，驗證腫瘤轉移和腫瘤大小與ESE3 mRNA表達水平的關系。

1.2.3 構建PANC-1 過表達ESE3 穩定轉染細胞系 利用慢病毒載體在低內源ESE3 表達的PDAC 細胞系PANC-1 中特異性的過表達ESE3，嘌呤霉素（1 g/L）篩選48 h 后得到穩定轉染的細胞系。并應用蛋白質免疫印跡法對轉染效率進行驗證。轉染空載質粒的細胞記為pCDH-Vector，轉染過表達ESE3 質粒的細胞記為pCDH-ESE3。

1.2.4 細胞遷移實驗檢測PANC-1 細胞侵襲能力 使用鋪有1∶5 稀釋的基質膠的Transwell 小室進行細胞遷移能力測定，用含有2%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，每個上室分別加入2×105個PANC-1 和PANC-1 過表達ESE3 細胞，含有10%胎牛血清的DMEM 培養基加入下室中，分別在常氧、乏氧和低糖條件下孵育細胞36 h，將遷移至小室底部的細胞使用三步染色法染色。

1.2.5 蛋白質免疫印跡法檢測ESE3、HIF-1α、GRP78表達情況 使用含10%胎牛血清的常規DMEM 培養基和含10%胎牛血清的低糖DMEM 培養基（含葡萄糖1 000 mg/L）培養PANC-1、SW1990細胞，放置于37 ℃、5%CO2的空氣濕潤的孵箱中0、6、12 h；乏氧處理時將細胞放置入乏氧孵箱中（0.1%O2、5%CO2和N2平衡氣中）37 ℃孵育，分別培養0、6、12 h。PANC-1、SW1990細胞經預冷PBS沖洗2遍后加入含有蛋白酶抑制劑的十二烷基磺酸鈉（SDS）細胞裂解液，研磨裂解取總蛋白，100 ℃加熱10 min。按照核-漿分離試劑盒說明書步驟提取上述乏氧和低糖條件下PANC-1、SW1990細胞的核蛋白與漿蛋白。HIF-1α、GRP78 分別作為乏氧和低糖的標志蛋白，Lamin B1作為核蛋白內參，α-Tubulin作為漿蛋白內參，β-actin或β-Tublin作為總蛋白內參。BCA法進行蛋白定量后每孔上樣20μg 于10%SDS-PAGE 電泳分離，以260 mA恒流轉至PVDF 膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，使用相應的抗體檢測目的蛋白，ECL曝光顯影。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 6 軟件分析數據。數據采用均數±標準差（）或M（P25，P75）表示，組間比較采用t檢驗、秩和檢驗或方差分析。多重比較用SNK-q檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。使用Kaplan-Meier 法估計不同ESE3 表達者的累積生存率，并用Log-rank法比較總生存率的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESE3蛋白在胰腺癌組織中的表達情況 99例胰腺癌組織ESE3 中高表達64例（64.65%），低表達35例（35.35%）；16例正常胰腺組織中ESE3 中高表達12例（75.00%），低表達4例（25.00%）。與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中ESE3 的表達水平降低（χ2=8.959，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 Results of the expression levels of ESE3 in tissues by optical microscope(immunohistochemistry stain,×200)圖1 光學顯微鏡觀察組織中ESE3的表達水平（免疫組化染色，×200）

2.2 胰腺癌中ESE3表達水平與預后的關系 結果表明，具有低表達ESE3的PDAC患者與高表達ESE3的PDAC 患者比較，總生存期（OS，14 個月vs.17 個月，HR=1.505，95%CI：1.042～2.600，Log-rankχ2=4.096，P=0.043）和無復發生存期（DFS，7 個月vs.11個月，HR=1.761，95%CI：1.280～3.316，Log-rankχ2=7.942，P=0.005）更短，見圖2。

Fig.2 OS curve and DFS curve with different ESE3 expression levels圖2 不同ESE3表達水平患者的OS曲線和DFS曲線圖

2.3 TCGA 數據庫驗證結果 轉移組患者的ESE3表達量低于非轉移組（P＜0.05）；不同腫瘤大小組的ESE3表達量差異無統計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of ESE3 mRNA expression in different clinicopathological data in TCGA database表1 TCGA數據庫中不同臨床病理資料中ESE3 mRNA表達量的比較 ［M（P25，P75）］

2.4 過表達ESE3 穩轉細胞系驗證 實驗結果顯示，與空載質粒相比，pCDH-ESE3 質粒可有效增加PANC-1細胞中ESE3的蛋白表達，見圖3。

Fig.3 The verification of ESE3 overexpression cell line圖3 過表達ESE3穩轉細胞系驗證結果

2.5 乏氧和低糖條件下過表達ESE3抑制胰腺癌細胞侵襲的能力 細胞遷移實驗結果發現過表達ESE3抑制了PANC-1細胞的侵襲能力；而在乏氧和低糖條件下，過表達ESE3的PANC-1細胞的侵襲能力與常規條件培養的過表達ESE3 的PANC-1 細胞相比顯著增強（F=552.333，P＜0.01），見圖4。

2.6 胰腺癌細胞中ESE3 和HIF-1α、GRP78 表達的關系 結果表明，乏氧和低糖條件下的PANC-1 和SW1990 細胞系隨著處理時間的延長，ESE3 表達降低，HIF-1α、GRP78表達增加，見圖5A～D。PANC-1細胞過表達ESE3后，ESE3蛋白表達增加，同樣伴隨HIF-1α、GRP78 表達降低，見圖5E。乏氧和低糖條件下處理PANC-1、SW1990 胰腺癌細胞系12 h 后，在細胞核中ESE3表達降低，而HIF-1α、GRP78的表達增加，見圖5F～I。

3 討論

3.1 ESE3 在胰腺癌組織中低表達 有文獻報道，食管鱗狀細胞癌［8］和前列腺癌［9-10］的腫瘤組織中ESE3蛋白的表達缺失。在本研究中，考慮到用RT-qPCR檢測mRNA表達水平的不穩定性，本文僅從蛋白水平觀察ESE3 在胰腺癌組織及胰腺癌細胞中的變化情況。發現胰腺癌組織中ESE3 蛋白表達水平比正常胰腺組織降低。為了進一步探討ESE3 的表達在PDAC進展中的意義，對患者ESE3表達水平與其臨床信息及病理資料之間的關系經單因素分析，結果顯示ESE3 的表達缺失與胰腺癌的不良預后相關，這表明ESE3 低表達是影響胰腺癌患者OS 和DFS 的危險因素。TCGA 數據庫證實腫瘤的轉移與ESE3 的表達水平密切相關，因此，ESE3蛋白表達的缺失在胰腺癌的進展過程中起重要的作用。此外，同樣發現了支持ESE3 作為胰腺癌抑癌基因的有力證據，使用ESE3穩定過表達的PANC-1細胞系來評估其侵襲能力的改變，發現ESE3的過表達可以抑制PANC-1細胞的侵襲能力。

Fig.4 Overexpression of ESE3 under hypoxic and glucose deprived conditions inhibited the invasion of PDAC cells(×100)圖4 在乏氧和低糖條件下過表達ESE3抑制胰腺癌細胞侵襲的能力降低（×100）

Fig.5 The relationship between the expression of ESE3 and HIF-1α,GRP78 in PDAC cell line圖5 胰腺癌細胞中ESE3和HIF-1α、GRP78表達的關系

3.2 乏氧和低糖可以降低ESE3抑制胰腺癌細胞的侵襲能力 胰腺癌組織一般處于乏氧和低糖的腫瘤微環境中，Zhu 等［11］課題組證實了胰腺導管腺癌組織中存在HIF-1α過表達，并且其過表達與淋巴結轉移相關。乏氧可以通過激活核轉錄因子HIF-1α 改變下游靶基因的轉錄水平［12］。另一方面，與正常細胞相比，腫瘤細胞對葡萄糖的攝取及代謝均處于增高狀態，糖代謝的增加是許多惡性腫瘤的顯著特征［5］。同時胰腺癌組織中HIF-1α、GRP78的過表達可以提高血管內皮生長因子（VEGF）和成纖維細胞生長因子（FGF）的表達，從而促進腫瘤血管的新生，并與胰腺癌的轉移相關［13］。為了在體外進一步了解ESE3 在乏氧和低糖條件下對胰腺癌細胞侵襲作用的影響，本研究對過表達ESE3的穩定轉染細胞系進行乏氧和低糖條件處理，結果發現，與pCDH-ESE3組相比，乏氧和低糖條件下的pCDH-ESE3胰腺癌細胞系的侵襲能力有所增強，提示乏氧和低糖微環境中ESE3的變化可能與腫瘤轉移相關。隨后，使用蛋白質免疫印跡法觀察到在乏氧和低糖條件下ESE3總蛋白的表達水平降低，同時伴隨HIF-1α、GRP78總蛋白表達水平增高；使用pCDH-ESE3 質粒轉染PANC-1 細胞系后，隨著ESE3 總蛋白的增加HIF-1α、GRP78總蛋白的表達下調。

由于ESE3作為核轉錄因子，在細胞核中執行轉錄調控的功能，直接調控下游靶基因，有文獻報道，ESE3可以直接結合并調控E-cadherin 的啟動子區，促進其表達，影響腫瘤細胞的浸潤和轉移［14］。為了驗證在乏氧和低糖條件下ESE3 蛋白在細胞核中的表達是否發生變化，本研究使用了核漿分離方法，結果表明ESE3蛋白在細胞核中表達降低，也伴隨著與HIF-1α、GRP78在細胞核中的表達水平增高。

綜上所述，在胰腺癌組織中ESE3表達水平顯著低于正常胰腺組織。此外，ESE3表達水平的降低與胰腺癌的轉移密切相關，低表達ESE3的胰腺癌患者預后不良。另在胰腺癌細胞系中，證實乏氧和低糖條件可以降低ESE3蛋白的表達，從而促進胰腺癌細胞系的侵襲，且ESE3與HIF-1α、GRP78呈負性表達關系。但乏氧和低糖引起ESE3 表達降低的具體機制還有待進一步研究，期望今后隨著本課題組對胰腺癌腫瘤微環境中各個組分及分子機制之間的深入研究，為腫瘤治療能提供更新的思路與方法。