干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中患者臨床療效的Meta分析

褚玉茹，于乃浩，闞建英

腦卒中是一種急性腦血管疾病，根據(jù)腦血管的病變不同，可將腦卒中分為缺血性和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占腦卒中總數(shù)的60%～70%［1］。據(jù)統(tǒng)計，在缺血性腦卒中患者中僅有30%～40%能夠完全康復(fù)或輕微功能障礙，50%～70%會失明、失語、遺留肢體癱瘓等重度殘疾，具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點［2］。缺血性腦卒中患者腦組織在短時間內(nèi)缺血缺氧并壞死，導(dǎo)致神經(jīng)元減少，軸突連接中斷，局部產(chǎn)生活性氧自由基，從而影響腦組織損傷后的修復(fù)，最終喪失局部腦功能和神經(jīng)組織。目前對于缺血性腦卒中患者的治療目的是改善腦部血液循環(huán)，增加缺血區(qū)的半暗帶區(qū)的血流及氧的供應(yīng)，控制腦水腫，防治并發(fā)癥［3］。針對腦梗死超早期溶栓治療的手段只有重組組織型纖溶酶原激活劑，或者外科機(jī)械取栓再灌注手術(shù)，并且這些手段都最好是在卒中發(fā)生后3～6 h 內(nèi)實施，才有可能取得療效［4］。中成藥和針刺治療急性腦梗死的療效尚需要更多高質(zhì)量隨機(jī)對照試驗證實［5］。近些年來，干細(xì)胞治療研究快速發(fā)展，臨床醫(yī)生也越來越重視干細(xì)胞移植治療各種難治性疾病，這些均基于干細(xì)胞具有多向分化潛能和高度自我復(fù)制能力。近期的研究發(fā)現(xiàn)，患者經(jīng)干細(xì)胞療法MultiStem 治療后1年內(nèi)康復(fù)程度持續(xù)改善，而且體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子和炎性免疫細(xì)胞水平顯著降低，免疫抑制相關(guān)感染減少［6］。筆者采用Meta 分析方法對國內(nèi)外公開發(fā)表關(guān)于多種來源干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中的安全性和臨床療效進(jìn)行評價，為臨床干細(xì)胞治療各種難治性疾病提供有力的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 計算機(jī)檢索PubMed、EMbase、Cochrane Library、維普數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫及CNKI數(shù)據(jù)庫公開發(fā)表的關(guān)于干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中患者的隨機(jī)對照試驗，檢索時間為建庫至2018年12月。中文檢索詞為“干細(xì)胞、缺血性腦卒中、腦梗死、治療”，英文檢索詞為“stem cell，ischemic stroke OR brain ischemia OR cerebral infarction，therapy OR treatment”，并進(jìn)一步通過文獻(xiàn)追溯相關(guān)領(lǐng)域研究者的報道進(jìn)行查漏。

1.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）截止到2018年12月在國內(nèi)外公開發(fā)表的關(guān)于干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中患者的文獻(xiàn)。（2）研究為隨機(jī)對照試驗。（3）病例入組標(biāo)準(zhǔn)為全國第五屆腦血管病學(xué)術(shù)會議關(guān)于缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)或符合WHO腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)。（4）功能結(jié)局指標(biāo)包括神經(jīng)功能缺損評分（NIH stroke scale，NIHSS）、日常生活能力指數(shù)（Barthel index，BI）、運動功能評分（Fugl-Meyer assessment，F(xiàn)MA）和功能獨立性情況（functional independence measure，F(xiàn)IM）。（5）研究數(shù)據(jù)包含治療組和對照組各功能結(jié)局指標(biāo)的均數(shù)（Mean值）及標(biāo)準(zhǔn)差（SD值）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究資料中無對照組或未提供對照組和治療組的來源。（2）入組患者無明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)。（3）參考Song 等［7］提供的標(biāo)準(zhǔn)對文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評價，排除中英文重復(fù)發(fā)表、非一次文獻(xiàn)的文獻(xiàn)、統(tǒng)計學(xué)信息不全及綜述性文獻(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)提取 由2名系統(tǒng)評價員獨立獲取文獻(xiàn)，互相核對獲取文獻(xiàn)結(jié)果，初步獲得文獻(xiàn)基本信息后，根據(jù)文獻(xiàn)的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)作進(jìn)一步的篩選。獲取文獻(xiàn)的主要內(nèi)容包括：（1）文獻(xiàn)的基本信息，包括作者、發(fā)表時間、臨床試驗性質(zhì)和入組病例數(shù)量等。（2）輸注的細(xì)胞類型、給藥途徑和劑量。（3）各功能結(jié)局指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 評價員提取文獻(xiàn)信息后，按統(tǒng)計學(xué)Meta分析的要求整理并交叉核對文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，建立納入文獻(xiàn)基本情況表。采用Stata 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。將治療組和對照組各功能結(jié)局指標(biāo)的基線終值差進(jìn)行合并，利用標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（SMD）作為效應(yīng)分析統(tǒng)計量。最終納入的文獻(xiàn)研究結(jié)果需要依據(jù)Stata 11.0 軟件繪制的森林圖來檢驗其異質(zhì)性。根據(jù)I2值來決定Meta分析模型的使用，若I2≤50%則用固定效應(yīng)模型，I2＞50%使用隨機(jī)效應(yīng)模型，最后進(jìn)行各效應(yīng)量的合并統(tǒng)計分析。若I2＜25%說明納入的文獻(xiàn)存在輕度異質(zhì)性，50%≤I2＜25%說明納入的文獻(xiàn)存在中度異質(zhì)性，I2＞50%說明納入的文獻(xiàn)存在高度異質(zhì)性。最后進(jìn)行合并效應(yīng)量的統(tǒng)計分析，同時采用Stata 11.0軟件繪制漏斗圖以分析納入文獻(xiàn)是否存在發(fā)表偏倚，并通過敏感性分析，尋找異質(zhì)性的來源。

2 結(jié)果

2.1 納入文獻(xiàn)的基本特征 計算機(jī)初步檢索到80篇中文文獻(xiàn)和55 篇英文文獻(xiàn)，按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，對文獻(xiàn)題目及摘要、重復(fù)發(fā)表情況和全文進(jìn)行篩選，最終納入21篇中文和8篇英文共計29個隨機(jī)對照試驗，見圖1。其中，有15項臨床研究應(yīng)用了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，5項臨床研究應(yīng)用了骨髓CD34+干細(xì)胞，5 項臨床研究應(yīng)用了神經(jīng)干細(xì)胞，3 項臨床研究應(yīng)用了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，2 項臨床研究應(yīng)用了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞。共包括治療組患者953例，對照組患者955例。見表1。

Fig.1 Flow diagram for document screening of the Meta analysis of stem cell therapies for patients with ischemic stroke圖1 干細(xì)胞治療缺血性腦卒中Meta分析的文獻(xiàn)篩選流程

Tab.1 Information of the included literatures in the Meta analysis of stem cell therapies for patients with ischemic stroke表1 干細(xì)胞治療缺血性腦卒中患者的Meta分析納入文獻(xiàn)信息

2.2 納入文獻(xiàn)的偏倚風(fēng)險評價 Cochrane 偏倚風(fēng)險工具一共考察7項條目，包括隨機(jī)序列的產(chǎn)生（選擇偏倚）、分配隱藏（選擇偏倚）、受試者與醫(yī)療提供者的盲法（操作偏倚）、結(jié)局評估者的盲法（檢測偏倚）、不完全結(jié)局信息（隨訪偏倚）、選擇性報告（報告偏倚）以及其他偏倚。在納入本次Meta分析的文獻(xiàn)中，有86.2%的研究采用了隨機(jī)分配的方式將入組患者分為治療組和對照組，同時采用了受試者與醫(yī)療提供者的雙盲。有86.2%的文獻(xiàn)在“分配隱藏（選擇偏倚）”中存在未知風(fēng)險。在結(jié)局評估者的盲法（檢測偏倚）和選擇性報告（報告偏倚）兩項條目中，所有納入文獻(xiàn)均無風(fēng)險。有1篇納入文獻(xiàn)［36］存在隨訪偏倚。此外，有17篇納入文獻(xiàn)（占比58.6%）在“其他偏倚”中存在著未知風(fēng)險。總體來說，本次Meta分析為低偏倚風(fēng)險，見圖2。

Fig.2 The diagram of risk of bias圖2 偏倚風(fēng)險圖

2.3 Meta分析結(jié)果及效應(yīng)評價

2.3.1 美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表評分（NIHSS） 有13 項研究［9-10，15-17，19，22，23，26-27，29-30，32］報道了NIHSS的改善情況。納入的研究結(jié)果存在高度異質(zhì)性（I2=85.2%，P＜0.01），采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，結(jié)果顯示，干細(xì)胞治療組NIHSS 改善情況優(yōu)于對照組，效應(yīng)量的95%置信區(qū)間不包含0，表示這13項研究的效應(yīng)量有統(tǒng)計學(xué)意義（SMD：-0.91，95%CI：-1.34～-0.48），見圖3。

Fig.3 The Meta analysis of neurological impairment score圖3 神經(jīng)功能缺損評分的Meta分析

2.3.2Barthel 指數(shù)（BI）有12項研究［8-10，16-20，22，28，32，36］報道了BI 的改善情況。納入的研究結(jié)果存在高度異質(zhì)性（I2=92.2%，P＜0.01），采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，結(jié)果顯示，干細(xì)胞治療組BI 改善情況優(yōu)于對照組，效應(yīng)量的95%置信區(qū)間不包含0，表示這12 項研究的效應(yīng)量有統(tǒng)計學(xué)意義（SMD：1.14，95%CI：0.50～1.78），見圖4。

Fig.4 The Meta analysis of Barthel index圖4日常生活能力評定量表的Meta分析

2.3.3 肢體運動功能評分（FMA） 有8 項研究［11，14，18，21，24，29，33，36］報道了FMA的改善情況。納入的研究結(jié)果存在高度異質(zhì)性（I2=91.9%，P＜0.01），采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，結(jié)果顯示，干細(xì)胞治療組FMA改善情況優(yōu)于對照組，效應(yīng)量的95%置信區(qū)間不包含0，表示這8 項研究的效應(yīng)量有統(tǒng)計學(xué)意義（SMD：1.36，95%CI：0.71～2.0），見圖5。

Fig.5 The Meta analysis of Fugl-Meyer assessment(FMA)圖5 肢體運動功能評分的Meta分析

2.3.4 功能獨立性評定量表（FIM） 有9 項研究［11-13，21，25，31，33-35］報道了FIM的改善情況。納入的研究結(jié)果存在高度異質(zhì)性（I2=93.2%，P＜0.01），采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，結(jié)果顯示，干細(xì)胞治療組FIM改善情況優(yōu)于對照組，效應(yīng)量的95%置信區(qū)間不包含0，表示這9 項研究的效應(yīng)量有統(tǒng)計學(xué)意義（SMD：1.21，95%CI：0.55～1.88），見圖6。

2.3.5 發(fā)表偏倚的評價 從圖7 中可以看出，漏斗圖基本上呈對稱狀，提示不存在發(fā)表偏倚。Begg 和Egger 相關(guān)檢驗的結(jié)果也同時表明本次Meta 分析無明顯發(fā)表偏倚（P＞0.1），見表2。但是，四項結(jié)局指標(biāo)的漏斗圖中均有2～7個點落在了漏斗圖的外面，該結(jié)果與森林圖異質(zhì)性檢驗結(jié)果相一致，見圖7。

Fig.6 The Meta analysis of functional independence measure(FIM)圖6 功能獨立性評定量表的Meta分析

Tab.2 The results of Begg's test and Egger's test表2 Begg檢驗和Egger檢驗發(fā)表偏倚結(jié)果

Fig.7 The funnel plot graph of publication bias圖7 發(fā)表偏倚的漏斗圖

2.3.6 敏感性分析 敏感性分析是通過排除某些低質(zhì)量的研究或非盲法的研究評估Meta 分析合并結(jié)果的穩(wěn)健性和可靠性的重要方法，以探討對總效應(yīng)的影響。從圖8中不難發(fā)現(xiàn)造成四項結(jié)局性指標(biāo)異質(zhì)性的來源。但是異質(zhì)性并不會影響整體Meta 分析結(jié)果。對于NIHSS和BI兩個結(jié)局指標(biāo)而言，所納入的18 項研究對于各結(jié)局指標(biāo)合并效應(yīng)量的影響程度較小，穩(wěn)定性好，結(jié)果較為可信。而對于FMA結(jié)局指標(biāo)而言，季興等［18］和胡晴等［21］的研究對于總效應(yīng)的影響較大。對于FIM 結(jié)局指標(biāo)而言，王旭等［31］的研究對于總效應(yīng)的影響較大。

Fig.8 The sensitivity analysis of included studies圖8 納入文獻(xiàn)的敏感性分析結(jié)果

3 討論

干細(xì)胞是一類具有無限增殖和高度分化潛能的細(xì)胞，具有自我更新復(fù)制能力。2013年12月1日，美國哥倫比亞大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心的科學(xué)家首次成功地將人體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了功能性的肺細(xì)胞和呼吸道細(xì)胞［37］。干細(xì)胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具有影響和最有應(yīng)用前景的生命科學(xué)研究領(lǐng)域。干細(xì)胞是自我復(fù)制還是分化為功能性細(xì)胞，主要取決于細(xì)胞本身的狀態(tài)和機(jī)體微環(huán)境因素。目前已經(jīng)公認(rèn)的腦卒中的危險因素有高血壓、糖尿病、老年、高脂血癥、吸煙、飲酒、遺傳傾向等。上述危險因素導(dǎo)致動脈粥樣硬化，最終引起腦卒中的發(fā)生。腦卒中會引發(fā)外周血液免疫細(xì)胞的浸潤以及原位免疫細(xì)胞的活化，從而引起炎癥反應(yīng)。抗炎是治療缺血性腦卒中的核心問題。干細(xì)胞的免疫正調(diào)節(jié)能力、細(xì)胞替代功能和免疫抗炎效應(yīng)對于急性和慢性損傷有著重要意義［38］。神經(jīng)干細(xì)胞移植結(jié)合一種名為3K3A-APC的蛋白有助于逆轉(zhuǎn)卒中后腦損傷。在小鼠模型中，這種蛋白能誘導(dǎo)干細(xì)胞變成有功能的神經(jīng)元。研究表明，3K3A-APC 能幫助移植干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元，與宿主的神經(jīng)系統(tǒng)建立起結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系［39］。Lee等［40］通過干細(xì)胞治療動物卒中模型實驗，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞輸注可有效改善動物模型的神經(jīng)功能，部分腦梗死面積減少。Toyoshima等［41］系統(tǒng)評價了12 篇關(guān)于干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中患者的臨床資料，綜述了干細(xì)胞移植途徑、輸注劑量和治療的機(jī)制。Sarmah 等［42］研究顯示干細(xì)胞治療腦卒中后患者NIHSS 等指標(biāo)均有一定程度的改善，證實了干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的潛能。

本研究針對不同功能結(jié)局指標(biāo)進(jìn)行Meta 分析和效應(yīng)評價。除NIHSS 指標(biāo)得分越低越好，其余3項指標(biāo)得分則越高越好。對于納入文獻(xiàn)的異質(zhì)性而言，NIHSS 指標(biāo)的I2值小于75%，存在中度異質(zhì)性，BI、FMA和FIM的I2值均大于75%，存在高度的異質(zhì)性。通過查看表1 推測異質(zhì)性來源于臨床試驗方案，如細(xì)胞輸注劑量、輸注方式和隨訪時間等。分析影響臨床治療效果的原因有：（1）干細(xì)胞的移植方式和輸注劑量會影響干細(xì)胞輸注體內(nèi)后的歸巢能力，決定其進(jìn)入體內(nèi)后是否能夠有效發(fā)揮其抗炎作用。（2）在局部微環(huán)境中，干細(xì)胞是否能定向分化為功能性細(xì)胞發(fā)揮重建神經(jīng)環(huán)路、血管發(fā)生和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用。在干細(xì)胞治療組和對照組各功能結(jié)局指標(biāo)合并效應(yīng)結(jié)果中，上述4 項結(jié)局指標(biāo)的合并效應(yīng)結(jié)果均有利于干細(xì)胞治療組，與張桂龍等［43-44］的Meta 分析結(jié)果相同。納入本次Meta 分析的文獻(xiàn)多數(shù)報道了分配隱藏、受試者與醫(yī)療提供者的盲法、結(jié)局評估者的盲法等偏倚風(fēng)險項。從上述四項結(jié)局指標(biāo)繪制的漏斗圖中可以看出，圖形左右對稱性較好，無發(fā)表偏倚，但是各結(jié)局指標(biāo)的漏斗圖均有2～7 個點落在了漏斗的外面，這與其相應(yīng)結(jié)局指標(biāo)的森林圖異質(zhì)性檢驗結(jié)果一致，說明這些點對應(yīng)的研究有可能是異質(zhì)性的來源。Begg 和Egger 相關(guān)檢驗的結(jié)果表明本次Meta 分析無明顯發(fā)表偏倚（P＞0.1）。敏感性分析結(jié)果顯示，對于FMA 結(jié)局指標(biāo)而言，季興等［18，21］的研究對于總效應(yīng)的影響較大。對于FIM 結(jié)局指標(biāo)而言，王旭等［31］的研究對于總效應(yīng)的影響較大。其他兩項結(jié)局指標(biāo)納入的研究對合并效應(yīng)量的影響程度較小，穩(wěn)定性好。

綜上所述，目前的臨床數(shù)據(jù)顯示，干細(xì)胞移植能有效改善腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損、日常生活能力、功能獨立性和肢體運動功能。國內(nèi)在干細(xì)胞移植治療腦卒中臨床后期隨訪的時間明顯短于國外研究。因此，在干細(xì)胞移植治療腦卒中的遠(yuǎn)期有效性和安全性方面尚需要更多高質(zhì)量的臨床數(shù)據(jù)支持。