miR-21調控PTEN/AKT通路影響LPS誘導下足細胞中MMP-2和MMP-9表達

陳翔，黃瑩，龍春藝，廖品琥

腎臟是膿毒癥發生發展過程中損傷的主要靶器官，其中足細胞損傷是導致膿毒癥并發急性腎損傷（AKI）的主要原因，而足細胞損傷的主要機制為內毒素和炎癥介質作用導致基底膜（glomerular basement membrane，GBM）的降解與重塑，并進一步造成足細胞從GBM 上脫落［1］，但具體機制尚未完全闡明?；|金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9可以通過分解GBM 主要成分Ⅳ型膠原參與GBM 重塑［2］。MMP-2、MMP-9在血清中的表達水平與膿毒癥患者預后有關，提示兩者可能通過調控GBM重塑影響預后［3］。同源性磷酸酶張力蛋白（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）信號通路在足細胞損傷和GBM重塑中起著重要作用［4］。miRNA 是一類非編碼調控RNA，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區（3′UTR）結合負調節靶基因表達［5］。其中miR-21 在心臟成纖維細胞中表達上升，通過調控細胞外基質（ECM）及相關基因的表達，參與膿毒癥時心臟損傷［6］。然而miR-21在膿毒癥時足細胞損傷GBM 重塑中的作用和潛在機制尚不清楚。本研究通過探討miR-21 對脂多糖（LPS）刺激下足細胞損傷模型中MMP-2、MMP-9表達的影響，并進一步探討miR-21在PTEN/AKT 信號通路中對MMP-2、MMP-9 的調控機制，為臨床診斷和治療膿毒癥并發AKI提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、儀器及試劑 小鼠足細胞購自上海中國科學院細胞庫。DU530超微量紫外分光光度計（德國Beckman公司），ABI 7500 實時熒光定量聚合酶鏈反應儀（美國Applied Biosystems 公司）、伯樂1658001 電泳儀、轉膜儀（美國BIORAD 公司），MultiskanMK3 酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司），JS-680B 全自動凝膠成像系統（上海培清科技有限公司）。MMP-2、MMP-9酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司），PCR引物、miRNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒（北京天根科技公司），miR-21 抑制劑（inhibitor）、模擬物（mimic）和對照物（上海吉碼公司），MMP-2、MMP-9、PTEN、AKT和p-AKT一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥AKI 相關miRNA 生物信息學分析 本研究在GEO 數據庫中的檢索關鍵詞為sepsis、sepsis microRNAs、sepsis AKI、sepsis AKI microRNAs 并補充檢索Google Scholar和百度學術，在不同時間點檢索2 次，納入芯片集在2010年后，沒有語言限制。

1.2.2 細胞培養 將足細胞接種于含10%胎牛血清培養基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱常規培養，每2 d換液1次，根據細胞生長情況進行傳代。

1.2.3 LPS 濃度選擇 將密度為1.0×105個/孔的足細胞接種于6孔板中過夜，按隨機數字表法分為正常對照組、1、5和10 mg/L LPS組，每組3個復孔。分別給予0、1、5、10 mg/L LPS刺激24 h，構建足細胞損傷模型。正常對照組給予相同體積的PBS。將培養板置于37 ℃培養箱中培養24 h。采用Western blot 檢測各組MMP-2、MMP-9 蛋白表達。根據Western blot結果選取最適宜的脂多糖濃度。

1.2.4 ELISA 檢測MMP-2、MMP-9 蛋白表達 按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測各組MMP-2、MMP-9表達水平。

1.2.5 細胞模型建立及轉染 將密度為1.0×105個/孔的足細胞接種于6孔板中過夜，按隨機數字表法分為正常對照組、脂多糖組（LPS組）、miR-21模擬物組（miR-21 mimic 組）、miR-21 模擬物對照組（miR-21 mimic NC 組）、miR-21 抑制物組（miR-21 inhibitor 組）和miR-21 抑制物對照組（miR-21 inhibitor NC 組），每組3 個復孔。LPS 組給予10 mg/L LPS 刺激24 h，構建足細胞損傷模型。正常對照組給予相同體積的PBS。miR-21 mimic/inhibitor 組在含有細胞的1 500μL培養基的培養孔中加入miR-21-mimic/inhibitor-lipo 2000混合液混勻；miR-21 mimic/inhibitor NC 組加入相同劑量miR-21-mimic/inhibitor NC-lipo 2000 混合液混勻。培養6 h 后，將含混合液的培養基移去，更換新鮮培養基，加入10 mg/L LPS，將培養板置于37 ℃培養箱中培養24 h。

1.2.6 PTEN 過表達與沉默 將密度為1.0×105個/孔的足細胞接種于6 孔板中過夜，按隨機數字表法分為正常對照組、LPS組、PTEN 過表達組、PTEN 過表達對照組、PTEN 沉默組、PTEN 沉默對照組，每組3 個復孔。LPS 組給予10 mg/L LPS刺激24 h，構建足細胞損傷模型。正常對照組給予相同體積的PBS。按照Lipofectamine2000操作說明進行操作，PTEN過表達組中將pCDNA3.1-PTEN轉染至足細胞中，PTEN沉默組將shRNA-PTEN 轉染至足細胞中。PTEN 過表達對照組和PTEN沉默對照組分別給予轉染對照質粒。培養6 h后，將含混合液的培養基移去，更換新鮮培養基，加入10 mg/L LPS，將培養板置于37 ℃培養箱中培養24 h。

1.2.7 熒光定量PCR 檢測miR-21基因表達 取傳3～8代的足細胞，按6×105個/孔接種于6 孔板中，37 ℃、5%CO2恒溫孵箱中培養12 h 后，去掉培養基。LPS 組加入10 mg/L LPS，對照組加入等量PBS，刺激6 h 后用離心柱法提取總RNA。按照反轉錄和熒光定量PCR試劑盒說明書進行逆轉錄和熒光。以U6為內參，數據采用2-ΔΔCt法進行分析，其中，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt LPS組-ΔCt正常對照組。

1.2.8 Western blot 檢測蛋白表達 取LPS 刺激后24 h 的各組細胞，加入細胞裂解液后提取蛋白，并用BCA 法檢測蛋白濃度。取60μg 蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結束后轉膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫封閉1 h，分別加入MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、PTEN（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）一抗，同時以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，1∶5 000稀釋）為內參，4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。洗膜結束后用凝膠成像系統進行顯影。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料用表示，2組間比較用成組t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，采用Pearson法行相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膿毒癥AKI 相關miRNA 生物信息學分析 選取的數據集為GSE94717，芯片標本分別來自健康人和膿毒癥AKI 患者，應用3例健康人和6例膿毒癥AKI 患者樣本的標準化表達數據，根據是否有統計學意義（P＜0.05）及其差異倍數（＞2）進行分析篩選，符合條件的差異表達的miRNA 共有231 個，部分差異miRNA表達情況見表1。由于差異表達的miRNA數據相對較多，結合前期研究和文獻分析選取miR-21作為研究對象。

Tab.1 Differentially expressed miRNA in GSE94717表1 GSE94717中部分差異表達的miRNA

2.2 各組miR-21 和MMP-2、MMP-9 表達及相關性分析 不同濃度LPS 刺激后，足細胞MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平升高，且呈濃度依賴性，見圖1。本研究選取10 mg/L的LPS處理細胞。熒光定量PCR 和ELISA 結果顯示，LPS 組足細胞miR-21、MMP-2、MMP-9蛋白表達量升高（均P＜0.01），見表2。LPS組中miR-21與MMP-2、MMP-9的表達呈正相關（r分別為0.462、0.534，均P＜0.05）。

Fig.1 Effects of different doses of LPS on expressions of MMP-2 and MMP-9 in podocytes圖1 不同劑量LPS對足細胞MMP-2、MMP-9表達的影響

2.3 miR-21促進LPS刺激下足細胞MMP-2、MMP-9 表達 miR-21 抑制物處理后，MMP-2、MMP-9 蛋白表達下降，差異有統計學意義（均P＜0.05）；miR-21模擬物處理后，MMP-2、MMP-9蛋白表達升高，差異有統計學意義（均P＜0.05）。見圖2、表3。

2.4 miR-21 靶向PTEN 參與LPS 刺激下足細胞損傷 miR-21靶基因分析結果顯示，miR-21與PTEN序列高度互補，PTEN可能為miR-21的靶基因，見表4。抑制miR-21 表達，PTEN 表達上升，p-AKT 表達降低（均P＜0.05）；miR-21 表達升高，PTEN 表達降低，p-AKT表達升高（均P＜0.05），見圖2、表5。

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-21,MMP-2 and MMP-9 between the two groups表2 2組miR-21、MMP-2和MMP-9表達水平比較（n=20，）

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-21,MMP-2 and MMP-9 between the two groups表2 2組miR-21、MMP-2和MMP-9表達水平比較（n=20，）

＊＊P＜0.01

組別正常對照組LPS組t miR-21（2－ΔΔCt）1.00±0 3.03±0.56 16.293＊＊MMP-2（mg/L）47.70±19.42 134.12±22.89 12.873＊＊MMP-9（mg/L）59.45±15.96 107.31±47.76 4.250＊＊

Fig.2 Effects of miR-21 mimic/inhibitor on MMP-2,MMP-9,PTEN and p-AKT protein expressions圖2 miR-21 模擬物/抑制物對MMP-2、MMP-9、PTEN和p-AKT蛋白表達的影響

Tab.3 The relative expression of MMP-2 and MMP-9 protein in six groups表3 各組MMP-2、MMP-9相對表達量比較（n=3，）

Tab.3 The relative expression of MMP-2 and MMP-9 protein in six groups表3 各組MMP-2、MMP-9相對表達量比較（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與LPS 組比較，P＜0.05；t1：miR-21 模擬物組與miR-21 模擬物對照組比較，t2：miR-21抑制物組與miR-21抑制物對照組比較；表5、6同

組別正常對照組LPS組miR-21模擬物組miR-21抑制物組F miR-21模擬物對照組miR-21抑制物對照組t1 t2 MMP-2 0.51±0.31 1.16±0.02a 1.28±0.03ab 0.65±0.02ab 632.822＊＊1.06±0.03 0.89±0.02 8.731＊＊17.373＊＊MMP-9 0.68±0.01 1.16±0.02a 1.32±0.07ab 0.56±0.03ab 253.574＊＊1.01±0.03 0.96±0.05 7.802＊11.647＊＊

2.5 PTEN/AKT 參與LPS 刺激下足細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達 抑制PTEN表達，p-AKT、MMP-2和MMP-9 蛋白表達上升（均P＜0.05）；過表達PTEN，p-AKT、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達下降（均P＜0.05）。見圖3、表6。

Tab.4 Bioinformatics analysis and prediction results表4 生物信息學分析預測結果

Tab.5 Comparison of the relative expression of PTEN and p-AKT protein between six groups表5 各組PTEN、p-AKT相對表達量比較 （n=3，）

Tab.5 Comparison of the relative expression of PTEN and p-AKT protein between six groups表5 各組PTEN、p-AKT相對表達量比較 （n=3，）

組別正常對照組LPS組miR-21模擬物組miR-21抑制物組F miR-21模擬物對照組miR-21抑制物對照組t1 t2 PTEN 0.73±0.04 0.84±0.02a 0.84±0.04a 0.67±0.01ab 18.397＊0.85±0.02 0.82±0.04 7.916＊1.135 p-AKT 0.52±0.01 0.47±0.01a 0.96±0.04ab 0.65±0.04ab 128.523＊＊0.77±0.04 0.83±0.02 5.962＊7.311＊AKT 0.66±0.01 0.65±0.02 0.63±0.03 0.50±0.02ab 53.393＊0.61±0.02 0.56±0.02 6.087＊2.662

Fig.3 Effects of pcDNA 3.1-PTEN and shRNA-PTEN on MMP-2,MMP-9 and p-AKT protein expressions圖3 過表達/沉默PTEN對MMP-2、MMP-9和p-AKT蛋白表達影響

Tab.6 Comparison of the relative expressions of MMP-2,MMP-9 and p-AKT protein between six groups表6 各組MMP-2、MMP-9和p-AKT相對表達量比較（n=3，）

Tab.6 Comparison of the relative expressions of MMP-2,MMP-9 and p-AKT protein between six groups表6 各組MMP-2、MMP-9和p-AKT相對表達量比較（n=3，）

組別正常對照組LPS組PTEN過表達組PTEN沉默組F PTEN過表達對照組PTEN沉默對照組t1 t2 MMP-2 0.66±0.01 1.07±0.02a 0.87±0.01ab 1.28±0.02ab 686.960＊＊1.13±0.01 1.09±0.01 37.277＊＊11.897＊MMP-9 0.66±0.01 0.82±0.03a 0.67±0.01b 0.92±0.01ab 144.586＊＊0.81±0.02 0.79±0.01 71.768＊＊16.350＊p-AKT 0.30±0.00 1.12±0.03a 0.73±0.01ab 1.26±0.04ab 1039.652＊＊1.12±0.03 1.15±0.03 21.264＊＊6.203＊AKT 0.65±0.01 0.64±0.03 0.61±0.03 0.64±0.04 24.504 0.63±0.05 0.63±0.04 2.217 3.719

3 討論

膿毒癥出現腎損害時預示病情危重且預后不良，因此，膿毒癥AKI的早期診斷和治療是膿毒癥治療的關鍵。本研究通過探討miR-21 對膿毒癥足細胞損傷模型中MMP-2、MMP-9 表達的影響，并進一步探討miR-21的可能調控機制，為臨床診斷和治療膿毒癥AKI提供理論依據。

3.1 MMP-2、MMP-9在LPS刺激下足細胞中表達升高 MMP-2、MMP-9 是可以降解GBM 的基質金屬蛋白酶家族的成員，被認為是一種具有潛在診斷價值的膿毒癥標志物，然而MMP-2、MMP-9 在膿毒癥足細胞損傷模型中的表達水平及與足細胞損傷的關系尚不明確。本研究通過構建膿毒癥足細胞損傷模型，在LPS 刺激下，足細胞MMP-2、MMP-9 表達上升，提示MMP-2、MMP-9 可能參與膿毒癥足細胞損傷，同時兩者表達隨LPS濃度上升而升高，提示兩者的表達水平可能反映膿毒癥時足細胞的損傷程度。這與既往研究結果一致，既往研究結果發現，膿毒癥患者血清中高水平的MMP-2、MMP-9 提示預后不良［3］，且與低水平MMP-2、MMP-9患者相比，發生多器官功能障礙綜合征的可能性升高［7-8］。因此，MMP-2、MMP-9能夠作為生物標志物診斷及判斷膿毒癥AKI患者預后。

3.2 miR-21在LPS刺激下足細胞中表達升高 LPS刺激MMP-2、MMP-9 表達升高的同時也介導miR-21表達升高。通過基因芯片分析，我們發現miR-21在膿毒癥AKI中差異表達，然而miR-21在膿毒癥足細胞損傷中的表達變化和具體作用尚不清楚。通過構建膿毒癥足細胞損傷模型，筆者發現LPS 刺激下的足細胞miR-21表達升高，這與基因芯片分析的結果相一致。然而，此結果與先前的一項研究結果相悖。該研究觀察到LPS 刺激后miR-21 的變化是動態的，6 h 內miR-21 表達升高，但無統計學意義［9］。導致本研究結果與該研究結果相悖有以下可能：（1）選取不同類型的細胞進行研究。細胞的功能會受到細胞來源、組織特異性和激活方式的影響，同時LPS的促炎癥作用具有細胞特異性。本研究使用的是足細胞，而該研究使用的是肺泡巨噬細胞NR8383。（2）LPS 干預劑量的差異。LPS 的促炎癥作用具有劑量依賴性，不同劑量LPS具有不同的生物學效應，低劑量LPS 主要促進細胞增殖，高劑量LPS 可誘導炎癥反應。本研究根據課題組前期研究基礎選取10 mg/L的LPS，而該研究采用的LPS劑量為1 mg/L。

其次，LPS 誘導miR-21 和MMP-2、MMP-9 表達上升，且miR-21 與MMP-2、miR-21 與MMP-9 之間呈正相關，但兩者之間是否存在調控關系尚不清楚。本研究通過構建miR-21過表達和抑制miR-21表達模型，結果發現過表達miR-21促進MMP-2、MMP-9的表達；而抑制miR-21能抑制MMP-2、MMP-9的表達。這與既往研究結果一致，既往研究觀察到蘇子油能通過抑制miR-21降低血管內皮細胞MMP-9表達［10］。同時miR-21 能通過PTEN 通路影響心臟成纖維細胞MMP-2表達［11］。這些結果表明miR-21可以影響MMP-2、MMP-9 表達，但具體調控機制尚不明確。

3.3 miR-21 對PTEN/AKT 通路的調控作用 為了進一步研究miR-21 調控MMP-2、MMP-9 表達的機制，通過生物信息學分析發現，miR-21與PTEN序列高度互補，PTEN 可能是miR-21 的靶基因。進一步發現過表達miR-21 可抑制PTEN 的表達，而抑制miR-21能促進PTEN的表達。這與生物信息學分析和既往研究結果一致，既往研究觀察到在乳腺癌［12］、肝癌［13］細胞中，PTEN 是miR-21 的直接靶點。這些結果表明miR-21 可以影響PTEN/AKT 通路，但miR-21 是否通過PTEN/AKT 通路影響MMP-2、MMP-9的表達尚不清楚。

3.4 PTEN/AKT 通路對MMP-2、MMP-9 的調控作用 進一步研究發現，過表達PTEN 能抑制p-AKT、MMP-2 和MMP-9 表達，沉默PTEN 能促進p-AKT、MMP-2和MMP-9表達，結果顯示PTEN/AKT可以影響MMP-2、MMP-9表達。而在本研究中，miR-21能靶向抑制PTEN/AKT 表達，miR-21 可能通過抑制PTEN/AKT 促進LPS 刺激下足細胞MMP-2、MMP-9表達。

綜上，miR-21、MMP-2 和MMP-9 與膿毒癥AKI的發生發展密切相關，監測膿毒癥患者miR-21、MMP-2和MMP-9水平有利于及早發現膿毒癥AKI，同時miR-21 可以通過抑制PTEN/AKT 通路的激活提高MMP-2、MMP-9 表達，對膿毒癥AKI 患者及早進行以miR-21 為靶點的干預治療可能取得較好效果，然而miR-21 調控GBM 降解與重塑的具體機制尚未闡明。目前已知PTEN 能抑制AKT/mTOR 自噬通路［14］。而本研究發現miR-21 會抑制PTEN/AKT通路激活，激活AKT/mTOR 通路而抑制自噬。miR-21 是否通過抑制自噬來調節GBM 重塑參與膿毒癥AKI進程仍需進一步的研究。