右美托咪定減輕新生期大鼠重復七氟醚吸入導致的遠期突觸可塑性損害

梁小麗，桂歡，劉程曦，張超，徐珊，張益△，朱昭瓊△

七氟醚是嬰幼兒期手術最常用的麻醉藥之一，具有誘導后蘇醒快、麻醉過程平穩等特點。嬰幼兒期是大腦快速發育的時期，在這一階段反復接受七氟醚麻醉可導致在幼年期和成年期的學習記憶能力下降，而七氟醚對海馬神經元突觸可塑性的損害可能是其中重要的機制［1］。因此，如何預防七氟醚對發育期大腦海馬突觸可塑性的影響成為臨床上防治七氟醚毒性作用的關鍵一環。近期有研究顯示，α2腎上腺受體激動劑右美托咪定（Dexmedetomidine，Dex）預處理可改善新生期七氟醚吸入導致的神經元凋亡［2］，然而Dex 是否可減輕七氟醚導致的遠期突觸可塑性的損害及由此引起的認知功能損害，目前仍然不清楚。本研究觀察Dex預處理對新生期大鼠重復七氟醚吸入導致的遠期突觸可塑性以及學習記憶能力損害的改善作用，為臨床工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。SD孕鼠7只，購自重慶陸軍軍醫大學實驗動物中心［SCXK（渝）2012-0005］，孕鼠于SPF級動物房飼養產仔，獲得健康新生期SD大鼠48只。（2）主要試劑。七氟醚（益君寧）購于魯南貝特制藥有限公司；鈉石灰購于英國Intersurgical 公司。（3）主要儀器。Morris水迷宮測試儀（成都泰盟科技有限公司），麻醉機（德國Drager公司），氣體監測儀（上海德爾格醫療設備有限公司），大鼠立體定位儀（美國stoelting公司），Model3000微電極放大器（美國A-M system公司），Mircro1401數模轉換器（英國CED公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型建立 采用隨機數字表法將動物分為3 組，分別為空白對照組（C 組）、單純七氟烷組（S 組）以及Dex 預處理組（DS 組），每組16 只。S 組分別于出生后7、14、21 d 分3 次間斷重復吸入2.6%七氟烷+運載氣體（1 L/min O2+1 L/min空氣）4 h，每次麻醉前20 min腹腔給予3 mL/kg的生理鹽水。C組給予3 mL/kg生理鹽水后放入相同環境中吸入運載氣體4 h，DS組將20μg/kg的Dex稀釋至3 mL/kg的生理鹽水中，行腹腔注射后再于相同時間點重復吸入七氟烷4 h。大鼠置于自制吸入麻醉箱中，箱底鋪一薄層鈉石灰，吸入過程中用自制水浴箱加熱，控制箱溫在30～34 ℃，氣體監測儀持續監測，保證進氣孔和出氣孔七氟烷濃度一致。麻醉過程中監測動物呼吸頻率和皮膚色澤，排除發生缺氧者。

1.2.2 學習記憶能力測試 當大鼠成長至幼年期時，采用抓鬮法從每組中隨機抽取8只大鼠于出生后第31天（d31）時進行Morris 水迷宮實驗。直徑1.2 m、高60 cm的圓形水池裝有溫水（23±1）℃，東南西北四個入水點把水池分為四個象限，在第一象限中央放置一直徑15 cm，高30 cm 的圓柱形平臺，低于水面2 cm。定位航行實驗前1 d，所有動物均放置于沒有平臺的水池中游泳120 s，以充分適應環境并淘汰不會游泳者。出生后第32～36 天（d32～36）行定位航行實驗，為期5 d，每天4次，水中加入奶粉使水變渾濁，使平臺不可見。將大鼠面向桶壁依次從4個象限入水。記錄大鼠找到平臺所用時間（即逃避潛伏期）并允許其在平臺上停留10 s，如大鼠在120 s內未發現平臺，則將其放置于平臺10 s，潛伏期計為120 s。d36定位航行實驗結束后2 h，行空間探索實驗，撤去平臺，大鼠游泳120 s，記錄在此期間經過原平臺位置的次數（跨臺次數）。數據的采集和處理由Morris水迷宮圖像自動監視處理系統完成。水迷宮實驗結束后1 d行在體電生理實驗。剩余大鼠繼續飼養至成年期，于d91～96 行定位航行實驗與空間探索實驗，其后行在體電生理實驗，方法同幼年期。

1.2.3 在體電生理實驗 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠頭部固定于大鼠立體定位儀上，根據大鼠腦立體定位圖譜（Paul Halasz&Lewis Tsalis，第五版）將自制綁定的同心圓刺激電極和金屬記錄電極［3］分別放置于海馬Schaffer 側支（前囟后4.2 mm，中線旁開3.8 mm，深度2.6～3.1 mm）和CA1區放射層（前囟后3.7 mm，中線旁開2.9 mm，深度1.8～2.3 mm）。電極放置過程中每10 s 給予1 個0.2 ms 強度為3～6 mA 的測試刺激，觀察其誘發的場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）的波形特征，以確定刺激和記錄電極位置。以能夠引起最大fEPSP 斜率刺激強度最小值的50%作為基礎刺激強度，波形穩定后記錄30 min基礎值。在給予高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）前，采用刺激間隔為25、50、75、100、150、200、250 ms，波寬為50 ms，強度0.1 mA 的連續2 次電刺激誘發雙脈沖易化（paired-pulse facilitation，PPF），每30 s 1次，每種刺激間隔給予3個雙脈沖刺激，計算PPF 率。PPF 率為第2 個脈沖刺激反應的峰值與第1 個反應峰值之比的百分率。隨后給予3 串200 Hz、0.1 mA的HFS以誘發長時程增強，每串20個，串間隔30 s。此后再以基礎刺激誘發fEPSP，fEPSP 斜率增加30%，維持30 min以上認為誘發長時程增強（long-term potentiation，LTP）成功，實驗記錄60 min 以確保LTP 的穩定性。fEPSP 斜率為fEPSP幅度除以時程，均以基礎值斜率作為100%，HFS后各時間點的斜率均為在此基礎上的百分比。觀察比較各組大鼠在37 d和97 d時強直刺激前后不同時間點fEPSP斜率的增幅以及不同刺激間隔的雙脈沖刺激所誘發的反應。所有實驗完成后大鼠用4%多聚甲醛灌注后取腦，經甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋后行HE染色，以確定電極位置是否準確。

1.3 統計學方法 所有數據統計學分析均采用SPSS 19.0處理，圖表繪制采用GraphPad Prism 6 完成。計量資料采用均數±標準差（）表示，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，3組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 水迷宮實驗結果 幼年期（37 d）和成年期（97 d）時的定位航行實驗中，5 d內逃避潛伏期均逐漸縮短；各組間逃避潛伏期比較，S組明顯長于C組和DS組（P＜0.05），C 組與DS 組比較差異無統計學意義；各組跨臺次數比較，S 組明顯少于C 組和DS 組（P＜0.05），C 組與DS 組比較差異無統計學意義，見表1、2。S組成年期第1天和第2天的逃避潛伏期較幼年期明顯縮短（t分別為3.139、2.429，P＜0.05），而跨臺次數較幼年期顯著增加（t=3.416，P＜0.01）。

2.2 各組LTP 比較 組織染色結果顯示所有在體電生理實驗電極位置均較為準確，結合腦立體定位以及記錄電極波形判斷電極位置的方法準確可行，見圖1A。37 d、97 d 時HFS 后各組fEPSP 斜率均增加30%以上，維持時間超過30 min，代表性的fEPSP見圖1B。幼年期和成年期S組fEPSP斜率在HFS后所有時間點的增幅均明顯低于C 組和DS 組（P＜0.05）；同時，成年期S組大鼠HFS后fEPSP斜率增幅在所有時間點均明顯高于幼年期（P＜0.05），成年期C 組大鼠HFS 后fEPSP 斜率增幅僅在30 min 和60 min兩個時間點高于幼年期（P＜0.05），DS組成年期與幼年期比較差異無統計學意義，見圖1C、D，表3。

2.3 各組PPF率比較 幼年期S組大鼠在刺激間隔為75、100、150、200、250 ms的PPF率較C組與DS組升高（P＜0.05），而成年期S 組大鼠在刺激間隔為100、150、200、250 ms 的PPF 率較C 組與DS 組升高（P＜0.05）；此外，S 組成年期大鼠與幼年期相比，在刺激間隔為50、100、150、200 ms 時的PPF 率降低（P＜0.05），而C組和DS組不同年齡大鼠PPF率比較差異無統計學意義，見圖2，表4。

3 討論

目前臨床上接受七氟醚麻醉的新生兒呈逐年增加趨勢，新生期七氟醚暴露是否會引起患兒在學齡期和成年期學習記憶能力低于正常人，成為廣泛關注的問題。然而，由于臨床研究觀察周期較長，目前尚未得出確切的結論［4］。大量的動物實驗研究仍然顯示，新生期重復七氟醚暴露可引起遠期海馬神經元的凋亡，同時長期抑制海馬神經元的LTP，由此導致在幼年期和成年期的學習記憶能力的下降［5-7］。Dex可通過多種途徑減少吸入麻醉藥導致的發育期神經元凋亡，產生即時神經保護作用［8-9］。然而Dex是否可以逆轉新生期重復吸入麻醉藥導致的遠期毒性作用，目前尚不清楚。

本研究結果顯示，Dex 預處理可顯著改善新生期大鼠七氟醚暴露對遠期海馬神經元LTP的抑制作用，并在行為學上顯著緩解七氟醚導致的學習記憶能力的障礙，說明了Dex 可通過調節長時程突觸可塑性產生遠期的神經保護作用。其可能的機制為：Dex通過激活α2受體緩解了發育期七氟醚暴露對腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）—原肌球蛋白受體激酶B（tropomyosin receptor kinase B，TrkB）通路蛋白表達的長期抑制［10］，使BDNF 等與海馬突觸可塑性密切相關的蛋白表達上調，從而恢復了海馬神經元的LTP效應。

Tab.1 Comparison of escape latency and crossing number between three groups of rats at juvenile age表1 幼年期3組大鼠逃避潛伏期與跨臺次數的比較（n=8，）

Tab.1 Comparison of escape latency and crossing number between three groups of rats at juvenile age表1 幼年期3組大鼠逃避潛伏期與跨臺次數的比較（n=8，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與S組相比，P＜0.05

組別C組S組DS組F逃避潛伏期（s）第1天47.50±8.16 72.13±7.82a 49.50±8.72b 22.023＊＊第2天39.00±6.28 59.00±9.07a 37.75±9.36b 17.510＊＊第3天30.50±4.04 46.63±9.24a 30.63±6.32b 14.569＊＊第4天22.25±4.40 36.00±6.61a 20.38±4.24b 21.552＊＊第5天13.75±3.99 28.13±6.13a 13.25±3.41b 26.298＊＊跨臺次數15.25±2.12 7.01±1.31a 14.50±4.45b 40.895＊＊

Tab.2 Comparison of escape latency and crossing number between three groups of rats at adult age表2 成年期3組大鼠逃避潛伏期與跨臺次數的比較（n=8，）

Tab.2 Comparison of escape latency and crossing number between three groups of rats at adult age表2 成年期3組大鼠逃避潛伏期與跨臺次數的比較（n=8，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與S組相比，P＜0.05

組別C組S組DS組F逃避潛伏期（s）第1天44.50±7.46 60.13±7.51a 48.25±6.36b 10.463＊＊第2天34.63±6.23 49.75±7.31a 38.63±6.32b 11.153＊＊第3天27.13±6.64 40.75±8.21a 30.63±6.63b 7.729＊＊第4天19.13±4.91 32.38±5.53a 20.13±4.52b 17.399＊＊第5天10.75±2.38 21.00±3.70a 11.75±3.01b 26.962＊＊跨臺次數15.00±2.83 9.50±1.60a 14.75±3.24b 10.986＊＊

Fig.1 DEX preconditioning ameliorated the suppression on LTP at CA1 region induced by repeated neonatal sevoflurane exposure at both juvenile and adult age圖1 DEX預處理可顯著改善新生期重復七氟醚吸入導致的幼年期和成年期海馬CA1區LTP抑制

Fig.2 DEX preconditioning reversed the effect of repeated neonatal sevoflurane exposure on PPF ratio of neurons in hippocampal CA1 region at juvenile and adult age圖2 DEX預處理可逆轉新生期重復吸入七氟醚對幼年期和成年期海馬CA1區神經元PPF率的影響

此外，Dex 還可顯著逆轉由新生期大鼠七氟醚吸入引起的PPF率升高。PPF率可反映短時程突觸可塑性，后者在海馬的功能活動中也扮演著重要的角色［11］。雙脈沖易化主要由突觸前機制參與，筆者前期研究顯示新生期重復吸入七氟醚后在幼年期和成年期不同的刺激間期的PPF 率均明顯升高［12］，這可能與突觸前膜內Ca2+濃度異常增加有關［13］。而有研究顯示，Dex 可抑制海馬神經元突觸前膜鈣離子流，降低突觸前膜鈣離子濃度［14］，這可能正是本研究運用Dex 預處理后，PPF 率在新生期大鼠單純七氟醚暴露基礎上發生明顯降低的重要原因。

有研究表明，新生期腹側海馬損傷的大鼠在42 d 后因損傷而引起的異常行為逐漸消失，到70 d 時原有全腦廣泛的糖代謝異常變化僅限于小部分的腦區，這一過程可能與大腦神經元的重組修復有關［15］。本研究也發現，無論是在行為學、LTP 還是PPF 率，新生期重復吸入七氟醚的影響在成年期時較幼年期明顯降低，說明盡管新生期七氟醚吸入的影響可持續至成年期，但其嚴重程度明顯減輕，這也可能是由于損傷的神經網絡代償與重組所致。而在給予Dex預處理后，幼年期和成年期的異常行為學和電生理指標均趨于正常，兩者之間差異消失，這進一步說明了Dex對新生期大鼠七氟醚暴露的遠期保護作用。

Tab.3 Comparison of F value for fEPSP slope before and after HFS between three groups and t value for fEPSP slope between juvenile and adult groups表3 3組大鼠高頻刺激前后fEPSP斜率比較F值以及各組幼年與成年期fEPSP斜率比較t值

Tab.4 Comparison of F value for PPF ratio between three groups and t value for PPF ratio between juvenile and adult groups表4 3組大鼠PPF率比較F值及各組幼年期與成年期PPF率比較t值

綜上所述，新生期大鼠七氟醚重復暴露可導致幼年期和成年期長時程、短時程突觸可塑性以及學習記憶能力的異常，Dex預處理可逆轉這些改變，改善認知功能，為臨床上防治七氟醚對發育期大腦的不良影響提供了新的策略。