心肌及蛛網(wǎng)膜下腔NGF基因轉(zhuǎn)染對1型糖尿病大鼠心臟損傷的保護(hù)作用

易劍敏，岳維，高盼，張偉男

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是一組由多病因引起的以高血糖為特征的代謝性疾病，主要累及神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是心臟的感覺神經(jīng)，可使軸突萎縮、脫髓鞘、再生潛能減弱、發(fā)炎及周圍神經(jīng)纖維進(jìn)行性喪失［1］。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中重要的一員，可通過作用于高親和力酪氨酸激酶受體A（tyrosine kinase A，TrkA）和低親和力p75受體（75 kd neurotrophin receptor, p75NTR），從而調(diào)控神經(jīng)纖維的生長、發(fā)育和再生［2］。由于高血糖的作用，糖尿病大鼠心臟感覺神經(jīng)病變可下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞NGF的生成，使受NGF調(diào)控的降鈣素基因相關(guān)肽（calcitomin gene-related peptide，CGRP）大幅度減少，進(jìn)而導(dǎo)致心功能的惡化［3］。重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）具有安全性好、免疫源性低、轉(zhuǎn)染時間長等特點，其中rAAV9 有較好的心臟親和力，rAAV2 有較強(qiáng)的噬神經(jīng)性［4］。本課題組前期研究表明，高血糖可使NGF表達(dá)減少［5］。本研究主要通過不同的轉(zhuǎn)染途徑介導(dǎo)NGF 基因轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠的心臟或脊髓組織，旨在比較不同轉(zhuǎn)染方法對糖尿病大鼠的心臟保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠36 只，7 周齡，體質(zhì)量200～220 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證：SCXK（京）2014-0013。所有實驗動物均置于室溫、避免異常環(huán)境刺激干擾、晝夜交替（12 h/12 h）條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周適應(yīng)新環(huán)境后開始實驗。本實驗分為兩個子實驗，實驗一中大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2 組（n=6）：對照組、糖尿病（DM 組）；實驗二中大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組（n=6）：糖尿病心臟轉(zhuǎn)染對照（MC）組、糖尿病心臟轉(zhuǎn)染（ME）組、糖尿病脊髓轉(zhuǎn)染對照（SC）組、糖尿病脊髓轉(zhuǎn)染（SE）組。實驗操作程序經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器 rAAV9-NGF-GFP（滴度1.2×1015μg/L）、rAAV9-GFP（滴度1.6×1015μg/L）、rAAV2-NGF-GFP（滴度1.2×1015μg/L）、rAAV2-GFP（滴度1.6×1015μg/L）均購自上海漢恒生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotin，STZ，美國Sigma 公司）；大鼠NGF ELISA 試劑盒、大鼠CGRP ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；小動物生命指標(biāo)檢測儀（四川儀器廠）；Leica CM-1850 恒冷切片機(jī)（德國Leica 公司）；BX-51 型熒光顯微鏡（日本TKO 光學(xué)儀器株式會社）；Novapath酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗一

1.3.1.1 1型糖尿病模型的制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，實驗一中的DM 組大鼠禁食24 h，繼以腹腔注射STZ（50 mg/kg）。連續(xù)測量之后7 d 的空腹血糖，以7 次血糖值均＞16.7 mmol/L為造模成功（實驗二中4組大鼠造模采用相同方法）。

1.3.1.2 測定大鼠甩尾反射潛伏期和蛋白表達(dá)情況 STZ注射前1 d及后第1、2、4、6、8、9周，使用甩尾儀紅外光源對準(zhǔn)大鼠尾尖端進(jìn)行照射，記錄從按下開關(guān)開始到大鼠因逃避熱痛而甩開尾巴的時間，即為甩尾反射潛伏期（tail flick latency，TFL）；第9周時取左心室心肌組織在液氮條件下研磨至粉末狀，按10 mL/g加入蛋白裂解液，冰盒裂解1 h（每10 min混勻1次）后，4 ℃、15 000×g離心30 min，取上清，嚴(yán)格按照說明書步驟，采用ELISA試劑盒測定樣本NGF和CGRP含量。

1.3.2 實驗二 本實驗采用的是2×2析因設(shè)計，兩個因素分別是因素A：轉(zhuǎn)染物，因素B：轉(zhuǎn)染途徑，兩因素各有2 個水平，共設(shè)置4組，見表1。

Tab.1 The experimental factors and levels and specific intervention programs of each treatment group表1 實驗因素、水平及各處理組的具體干預(yù)方案

1.3.2.1 病毒轉(zhuǎn)染 大鼠糖尿病成模后第4周，以7%的水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，經(jīng)口直視下氣管插管，連接呼吸機(jī)控制呼吸。將MC、ME 組大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺，在胸骨體偏左側(cè)1 cm暴露心尖部，以心尖部為注射區(qū)域，網(wǎng)格狀選取5個注射點（點間隔約1 mm，深度1～2 mm），注射滴度為0.8×1013μg/L 的rAAV9-GFP、rAAV9-NGF-GFP 各100μL（每注射點20μL），逐層關(guān)胸。將SC、SE 組大鼠頸部墊高，仰臥位固定于手術(shù)臺上，暴露手術(shù)視野，選取寰椎和樞椎的間隙進(jìn)針見腦脊液流出后，將導(dǎo)管置入蛛網(wǎng)膜下腔后固定，注射滴度為0.8×1012μg/L 的rAAV2-GFP、rAAV2-NGFGFP各25μL，封閉導(dǎo)管外口，術(shù)后次日拔管。各組大鼠術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射慶大霉素10 000 U以預(yù)防感染。

1.3.2.2 心功能指標(biāo)的監(jiān)測 糖尿病造模后第9 周（轉(zhuǎn)染后第5 周），各組以25%的烏拉坦（5 mL/kg）腹腔麻醉，測血糖、體質(zhì)量。連接小動物生命指標(biāo)檢測儀，監(jiān)測大鼠心電圖，分離大鼠右側(cè)頸動脈，置動脈導(dǎo)管監(jiān)測左心室收縮壓（left ventricular developed pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、心率（heart rate，HR）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）等指標(biāo)。

1.3.2.3 熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá) 造模后第9周，取大鼠心臟、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG），包埋后冰凍切片，立即在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，因rAAV-NGF自身攜帶GFP標(biāo)簽，GFP 自發(fā)綠色熒光，故可直接冰凍切片后觀察GFP 的表達(dá)情況，由此驗證外源基因NGF是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入組織中。

1.3.2.4 心肌、脊髓、DRG組織NGF、CGRP含量測定 第9周時取左心室心肌組織，T1-T5脊髓及DRG組織在液氮條件下研磨至粉末狀，按10 mL/g加入蛋白裂解液，冰盒裂解1 h（每10 min混勻1次）后，4 ℃、15 000×g離心30 min，取上清，嚴(yán)格按照說明書步驟，采用ELISA試劑盒測定樣本NGF和CGRP含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，實驗一均數(shù)比較采用重復(fù)測量方差分析，實驗二均數(shù)比較采用2×2析因設(shè)計方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗一

2.1.1 2組TFL比較 隨著時間的延長，大鼠的甩尾潛伏期逐漸延長（P＜0.05），在注射STZ 后DM 組大鼠的甩尾潛伏期長于對照組（P＜0.05），見表2。

2.1.2 各組心肌組織中NGF、CGRP 的表達(dá) 與對照組相比，DM 組大鼠心肌組織中的NGF、CGRP 等蛋白含量明顯下調(diào)（P＜0.05），見表3。

Tab.2 Comparison of tail flick latencies at different time points between two groups表2 各組大鼠甩尾潛伏期的比較（n=6，s，）

Tab.2 Comparison of tail flick latencies at different time points between two groups表2 各組大鼠甩尾潛伏期的比較（n=6，s，）

F時間=1 412.39＊＊，F(xiàn)組別=1 305.94＊＊，F(xiàn)交互=293.49＊＊；＊＊P＜0.01

對照組DM組18.80±0.24 22.95±0.24 19.18±0.19 27.26±0.36 19.58±0.38 29.00±0.37

Tab.3 The expressions of NGF and CGRP in myocardium in two group表3 大鼠心肌組織中NGF、CGRP的含量 （ng/g，）

Tab.3 The expressions of NGF and CGRP in myocardium in two group表3 大鼠心肌組織中NGF、CGRP的含量 （ng/g，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表5、7同

對照組DM組F 6 6 75.08±6.35 45.46±6.66 62.03＊＊24.82±1.91 14.59±1.40 112.11＊＊

2.2 實驗二

2.2.1 各組心功能指標(biāo)的變化 轉(zhuǎn)染物和轉(zhuǎn)染途徑均對大鼠的心功能有影響（P＜0.05），轉(zhuǎn)染途徑對大鼠的LVSP 影響不明顯（P＞0.05），轉(zhuǎn)染物和轉(zhuǎn)染途徑對-dP/dtmax 的影響不存在交互效應(yīng)（P＞0.05）。兩者對其他觀察指標(biāo)都有明顯作用，并存在明顯的交互作用（P＜0.05）。見表4、5。

Tab.4 Comparison of cardiac functions between four groups of rats表4 各組大鼠心臟功能的比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of cardiac functions between four groups of rats表4 各組大鼠心臟功能的比較（n=6，）

組別MC組ME組SC組SE組LVSP（mmHg）99.17±9.15 144.63±12.22 109.81±21.03 120.76±3.33 LVEDP（mmHg）-2.27±1.37-4.86±0.80-2.31±1.21-2.70±0.37 HR（次/min）214.00±21.59 315.33±12.32 220.33±20.66 247.67±9.75組別MC組ME組SC組SE組+dP/dtmax（mmHg/s）7 369.68±800.82 11 642.87±1 921.67 6 809.76±539.71 7 640.10±798.97-dP/dtmax（mmHg/s）-5 033.91±412.21-7 556.71±921.80-4 767.41±995.01-6 110.97±325.49

2.2.2 大鼠心臟、脊髓及DRG中GFP的表達(dá) 左心室的心肌注射部位、脊髓灰質(zhì)及DRG 中有大量的GFP蛋白散在分布于細(xì)胞內(nèi)，表明病毒已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，見圖1。

2.2.3 心肌、脊髓、DRG 組織中NGF、CGRP 含量的變化 ME 組大鼠心肌組織中NGF、CGRP 的蛋白含量較其他組大鼠明顯上調(diào)，SE組大鼠T1-T5段脊髓和T1-T5 段DRG 組織中NGF、CGRP 的蛋白含量較其他組大鼠明顯上調(diào)；轉(zhuǎn)染物和轉(zhuǎn)染途徑均對大鼠組織中的NGF、CGRP有影響（P＜0.05），且二者之間存在明顯的交互作用（P＜0.05）。見表6、7。

Tab.5 Analysis of variance of factorial design of cardiac functions in five groups of rats表5 大鼠心臟功能析因設(shè)計方差分析結(jié)果

Fig.1 The expression of green fluorescent protein in tissues圖1 各組織中綠色熒光蛋白的表達(dá)

Tab.6 The expressions of NGF and CGRP in different tissues of each group表6 大鼠不同組織中NGF、CGRP的含量 （ng/g，）

Tab.6 The expressions of NGF and CGRP in different tissues of each group表6 大鼠不同組織中NGF、CGRP的含量 （ng/g，）

組別MC組ME組SC組SE組n6 6 6 6 NGF心肌組織41.88±6.31 81.67±6.74 42.18±4.62 53.78±3.17 T1-T5脊髓75.19±3.28 102.52±5.06 80.72±3.40 159.95±8.04 T1-T5 DRG 64.64±7.50 74.02±3.84 62.52±3.80 137.92±7.52組別MC組ME組SC組SE組n6 6 6 6 CGRP心肌組織14.16±0.96 25.68±1.07 14.61±1.54 16.97±0.76 T1-T5脊髓34.23±2.68 39.41±2.93 33.40±1.84 53.16±2.15 T1-T5 DRG 25.31±2.07 31.97±2.92 24.45±2.33 46.71±2.71

3 討論

長期的高血糖、低胰島素血癥及血脂異常容易促使DPN 病程的進(jìn)展［5］，使外周小神經(jīng)纖維的功能和形態(tài)受損，引起遠(yuǎn)端對稱性多發(fā)性周圍神經(jīng)病變、軸突萎縮、再生潛能減弱［6］。DPN 極易影響心臟的感覺神經(jīng)，使NGF 及其下游的相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致左室收縮舒張功能障礙，內(nèi)皮和心肌細(xì)胞凋亡，神經(jīng)纖維變性、缺失和異常再生［7］。糖尿病心臟感覺神經(jīng)病變發(fā)病機(jī)制包括缺血性微血管病變、NGF 及其受體的缺乏、晚期糖基化終末產(chǎn)物的過度產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂等，其中NGF及其受體的缺乏是一個極其重要的機(jī)制［8］，與本研究結(jié)果一致，注射STZ后的DM組大鼠與對照組相比發(fā)生了DPN，且第9 周時糖尿病大鼠心肌組織中的NGF的含量顯著下調(diào)。

Tab.7 Analysis of variance of factorial design of expressions of NGF and CGRP in different tissues of each group表7 各組大鼠不同組織中NGF、CGRP析因設(shè)計方差分析結(jié)果

NGF是最早發(fā)現(xiàn)的一種介于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)之間的神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過受體TrkA 及p75NTR激活PI3K/Akt、MEK/ERK 等通路，上調(diào)CGRP 的表達(dá)，從而調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的分化、增殖及凋亡［2］。心房及心室肌內(nèi)含有大量的CGRP-IR 纖維，當(dāng)CGRP 與其受體結(jié)合后，可以激活鳥苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷和前列腺素的釋放，發(fā)揮強(qiáng)大的舒血管作用，同時心肌收縮力、心輸出量及心率上升，血液黏稠度降低［13］。實驗二中ME組大鼠心肌轉(zhuǎn)染NGF基因后，過表達(dá)的NGF 促使心肌組織中的CGRP 含量明顯增多,而增多的CGRP使大鼠心臟的收縮及舒張功能明顯改善，考慮可能是因為ME 組以心肌點注射法可以有效地轉(zhuǎn)染表達(dá)NGF 基因，使下游蛋白CGRP 上調(diào)，產(chǎn)生了心臟保護(hù)作用，這與Meloni 等［6］的研究結(jié)果一致，Meloni 在糖尿病小鼠中外源性補充NGF，從而激活心臟Akt/Foxo3a 通路，促進(jìn)CGRP等心臟保護(hù)性蛋白的表達(dá)，營養(yǎng)正常的神經(jīng)纖維，減少心肌細(xì)胞的凋亡，改善糖尿病導(dǎo)致的心臟神經(jīng)病變。與此同時，大量的研究表明DPN時NGF可以通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［10］，抑制神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的凋亡，促使胰島β 細(xì)胞分泌胰島素或者上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）發(fā)揮其強(qiáng)大的生物學(xué)效應(yīng)［11］。已有研究證實，糖尿病心臟感覺神經(jīng)病變時，高血糖激活多元醇途徑，上調(diào)醛糖還原酶對葡萄糖的親和力，使山梨醇含量增高，從而引起神經(jīng)細(xì)胞水腫，神經(jīng)纖維節(jié)段性脫髓鞘，神經(jīng)細(xì)胞丟失大量的內(nèi)肌醇，引起神經(jīng)功能減退，同時內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞合成的NGF 及其靶基因CGRP 下調(diào)，進(jìn)一步加重神經(jīng)的損傷［12］。

基因治療為糖尿病心臟感覺神經(jīng)病變開創(chuàng)了新的治療途徑。蛛網(wǎng)膜下腔及心肌點注射法均可將NGF 基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至大鼠體內(nèi)并過表達(dá)，但以心肌點注射法轉(zhuǎn)染時沒有DRG 外膜及血腦屏障的限制，且不易受外來物的影響，可以減低炎癥免疫反應(yīng)，技術(shù)更加成熟，效果更加確切。在本研究中，分別以心肌點和蛛網(wǎng)膜下腔注射法轉(zhuǎn)染rAAV-NGF基因至糖尿病大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染rAAV-NGFGFP及以心肌組織為轉(zhuǎn)染途徑均可使大鼠的各項心功能指標(biāo)得到改善，使心肌組織中NGF、CGRP 蛋白含量上調(diào)；且兩個因素之間存在交互作用，故糖尿病大鼠心肌點注射rAAV-NGF-GFP 時可以發(fā)揮更大的心臟保護(hù)作用。研究顯示，加大腺相關(guān)病毒的病毒顆粒可以部分對抗軟脊膜、DRG 外膜及血-腦的屏障作用，但過大的病毒顆粒可能會引起機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，從而出現(xiàn)各種新的不可預(yù)測的并發(fā)癥［14］。因此，盡管蛛網(wǎng)膜下腔注射法轉(zhuǎn)染NGF 基因可以改善大鼠的外周感覺神經(jīng)病變［14］，但是病毒攜帶的基因并不能較好地在心肌組織中轉(zhuǎn)錄翻譯，不能發(fā)揮心臟感覺神經(jīng)病變的保護(hù)作用，故在糖尿病心臟感覺神經(jīng)病變中心肌點注射法轉(zhuǎn)染NGF基因應(yīng)作為治療的更優(yōu)選擇。

綜上所述，與蛛網(wǎng)膜下腔注射法相比，心肌點注射法可以增加心肌外源性NGF 的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠感覺神經(jīng)病變，改善心功能，產(chǎn)生心臟保護(hù)作用，為臨床有效地控制DPN，尤其是心臟的感覺神經(jīng)病變，提供了新的治療思路。