Panx1在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

張暉力，牟妍希，田雨，楊立群，王林

根據2018年全球癌癥統計數據，肺癌患者占確診的癌癥患者總數的11.6%，同時肺癌的死亡人數占癌癥總死亡人數的18.4%，肺癌以高發病率和高死亡率居于首位，其中非小細胞肺癌（NSCLC）患者約占所有肺癌患者人數的80%［1］。迄今為止，手術仍然是NSCLC最有效的治療選擇，但仍然有一部分NSCLC 患者診斷時已經進入晚期疾病階段，錯過最佳的手術時機，導致預后不佳。因此，尋找NSCLC發生發展中重要的分子靶點可以為NSCLC 的診斷及預后評估提供新的思路。2000年，Panchin等［2］研究發現了縫隙連接通道蛋白家族的3 個新成員，包括Panx1、Panx2 和Panx3。近年來的研究表明，Panx1 與多種腫瘤的分化、轉移存在相關性［3］。然而，Panx1 在NSCLC 方面的研究還鮮有報道。本研究運用Real-time PCR、免疫組化等技術檢測NSCLC組織及癌旁組織中Panx1 的表達情況，并進一步分析其在NSCLC方面的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年11月—2017年12月大連大學附屬新華醫院收治的30例肺癌患者的組織標本，病理診斷均為NSCLC，保留癌組織及配對的癌旁組織，其中的25例組織標本進行了實時熒光定量PCR和免疫組化實驗，另5例組織標本只進行了免疫組化實驗?；颊咧心?5例，女15例，年齡39～77歲，平均（58.43±10.71）歲。病理分級按照WHO病理分級標準：高分化13例，中分化11例，低分化6例。臨床分期采用國際抗癌聯盟第7版肺癌TNM分期標準，其中：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例。選取大連大學附屬新華醫院病理科保存的10例正常肺組織蠟塊作為免疫組化實驗的對照組。所有標本入組標準：患者病歷資料完整，術前均無放化療。所有研究對象對本次研究知情并簽署知情同意書。Panx1兔抗人一抗及山羊抗兔IgG 二抗選購自Bioworld 公司，免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB 染色試劑盒購自邁新公司，RNA 提取試劑盒（No.9108）、去除基因組DNA 的反轉錄試劑盒（No.RR047A）、SYBR熒光染料（No.RR066A）購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。實時熒光定量PCR 儀購自博日科技公司（型號：FQD-96A），核酸及蛋白分析儀選自Biochrom 公司（型號Biowave DNA），PCR核酸擴增儀購自基因有限公司（型號：2720型）。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR （1）引物序列。目的基因Panx1 上游5′- CCTGACAAACCTTGGCATGA-3′，下游5′ -CAGAAGTCTCTGTCGGGCATT-3′，擴增產物169 bp；內參基因β-actin 上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴增產物186 bp。（2）RNA 提取。采用RNA 提取試劑盒提取RNA，提取的總RNA 經凝膠電泳檢測完整性，并用核酸蛋白分析儀檢測RNA 純度及濃度，A280/A260≥1.8 為合格，可用于逆轉錄；cDNA合成：取1 μg RNA 進行逆轉錄反應；熒光定量PCR 反應條件：預變性95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環。每個樣本設置3 個檢測復孔。以2-ΔCt值代表樣本中Panx1 mRNA的相對表達水平。

1.2.2 免疫組化 將收集到的蠟塊組織按3μm 厚度切片，貼片、烘烤后采用MaxVision 法進行免疫組化。切片經脫蠟脫水干燥，檸檬酸鹽煮沸行抗原修復，自然冷卻后PBS沖洗3次，每次2 min，滴加3%H2O2處理10 min 滅活內源性酶，PBS沖洗3次，每次2 min，滴加Panx1兔抗人一抗（1∶100）孵育60 min，PBS 沖洗3 次，每次2 min，滴加山羊抗兔IgG 二抗孵育10 min，之后用PBS 沖洗3 次，每次2 min，DAB 染色、蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍、梯度乙醇脫水透明后封片，于顯微鏡下觀察。

由2位病理科醫師雙盲閱片。染色強度評分：無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性細胞百分比評分：≤5%計0 分，5%～25%計1 分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；總分為染色強度評分與陽性細胞百分比評分的乘積［4］，總分＜4分為陰性，總分≥4分為陽性。

1.3 統計學方法 用SPSS 20.0統計軟件進行分析。計量資料用均數±標準差（）表示，癌組織及癌旁組織間比較采用配對樣本t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Panx1 mRNA在NSCLC組織及配對癌旁組織中的表達 25例NSCLC組織中Panx1的相對表達量為25.31±3.55，與其配對的癌旁組織中Panx1的相對表達量為12.42±2.29，癌組織中Panx1 mRNA的表達水平高于與其配對的癌旁組織，差異有統計學意義（t=4.030，P＜0.01）。

2.2 Panx1蛋白在NSCLC 組織、癌旁組織及正常肺組織中的表達 Panx1蛋白主要在胞質中表達，陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色分布，見圖1。癌組織、癌旁組織、正常肺組織中Panx1 蛋白的陽性表達率分別為50%（15/30）、13.3%（4/30）、0，癌組織中的Panx1蛋白的陽性表達率均高于配對癌旁組織及正常肺組織，差異均有統計學意義（χ2分別為9.320、6.009，均P＜0.017）。

2.3 Panx1蛋白的表達與臨床病理特征的關系 不同年齡、性別、胸膜侵襲情況、病理分級分組肺癌患者組織中Panx1蛋白的陽性表達率比較差異無統計學意義。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期組的Panx1 蛋白陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期組，有淋巴結轉移組的Panx1蛋白陽性表達率高于無淋巴結轉移組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Relationship between Panx1 expression and clinicopathological parameters of NSCLC patients表1 Panx1蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系例（%）

3 討論

Panx1 是細胞膜上的六聚體半通道，細胞外K+濃度的升高、對細胞膜的機械拉伸刺激、膜電壓的變化、S-亞硝基化、一氧化氮（NO）、細胞外pH的變化、與嘌呤能和腺苷受體的相互作用或caspase3的切割都可以導致Panx1半通道的開放［5］。Panx1半通道的開放在腫瘤細胞凋亡過程中起重要作用，細胞膜上Panx1半通道在腫瘤細胞凋亡過程中被激活開放，導致三磷酸腺苷（ATP）由細胞內釋放到細胞外，進而使胞外ATP 濃度升高，而腫瘤微環境中的高水平ATP作為一種信號，可引起巨噬細胞、細胞毒性T細胞的募集，從而促進腫瘤抗原呈遞和抗腫瘤免疫［6-7］。同時，胞外ATP 濃度的升高還可進一步使Panx1 通道開放，進而形成正反饋，擴大Panx1 在細胞凋亡中的作用［8］。

Furlow 等［9］研究證實Panx1 通道的小分子抑制劑可降低乳腺癌轉移的效率。Penuela 等［10］研究發現Panx1 在黑素瘤進展過程中上調，可促進腫瘤生長和轉移。Wei 等［11］研究發現用Panx1 siRNA 轉染后，U87-MG 惡性神經膠質瘤細胞系的增殖減少。Swayne等［12］研究發現敲除Panx1可以促進神經母細胞瘤的分化，從而降低神經母細胞瘤的惡性表型。這些研究證實在某些腫瘤細胞中Panx1 的表達上調，并且可以增加某些腫瘤細胞的轉移能力。因此，選擇性抑制Panx1的表達和功能可能為某些癌癥的治療帶來新的思路。

Derangere 等［13］研究發現肝X 受體β 與Panx1 相互作用后，可以特異性誘導caspase-1依賴性結腸癌細胞死亡。Xie 等［14］研究發現Panx1 是潛在的腫瘤抑制因子，在肝癌細胞組織中以甲基化的形式存在。Wu 等［15］研究發現上調Panx1 的表達可以降低睪丸癌細胞株I-10/DDP的耐藥性，從而增強順鉑對耐藥型睪丸癌細胞的毒性作用。Xiang 等［16］證實Panx1通過獨立于其規范通道功能的過程在體外和體內減輕橫紋肌肉瘤的惡性特性。劉傳亮等［17］研究顯示Panx1在肝癌組織中的表達量明顯低于癌旁組織，并且Panx1的過表達能夠明顯抑制體內外肝癌細胞增殖能力。這些研究證實Panx1在不同的腫瘤細胞中的作用存在差異，提示可以針對不同的腫瘤細胞采用不同的Panx1 干預，這可能為臨床上不同腫瘤的靶向治療提供新的靶點和依據。

Fig.1 Immunohistochemical detection of Panx1 expressions in different tissues(×200)圖1 免疫組化檢測不同組織Panx1的表達（×200）

本研究中，PCR 結果和免疫組化結果均顯示NSCLC組織中Panx1的相對表達水平顯著高于與其配對癌旁組織。這提示Panx1在NSCLC的發生中起到一定的作用，然而Panx1 在NSCLC 中起促進作用或是代償性抑制作用仍待進一步探究。本研究結果顯示，臨床TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組的Panx1蛋白陽性表達率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期組，提示Panx1在NSCLC的進展中起到重要作用，高水平的Panx1 表達可能預示NSCLC進展到了晚期階段。此外在有淋巴結轉移的患者的NSCLC 組織中，Panx1 蛋白的陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移組，提示Panx1 可能參與NSCLC 的遠處轉移及侵襲過程，有助于為臨床上淋巴結轉移的風險評估提供依據。

綜上所述，Panx1 可能在NSCLC 的發生發展及轉移侵襲中起重要作用，為臨床上NSCLC的早期診斷及預后情況評估提供新的思路。然而Panx1 在NSCLC 發生發展及轉移中的具體作用仍未明確，今后將從細胞層面揭示Panx1在NSCLC的發生發展及轉移侵襲中的具體作用，進而為NSCLC的治療提供新的思路。