扶脾化瘤飲誘導(dǎo)胃癌小鼠細(xì)胞凋亡和相關(guān)凋亡基因表達(dá)的機(jī)制研究*

楊 潔,范引科, 宋延平,李 曄

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

材料與方法

1 受試動(dòng)物 KM小鼠,SPF級(jí),雄性,18g～22g, 購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。

2 藥物及瘤株 扶脾化瘤飲, 陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心,生產(chǎn)批號(hào):20170608。小鼠胃癌(MFC)瘤株，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

3 試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)試劑： 7-AAD(美國(guó)Sigma )；AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，小鼠免疫組化Bcl-2試劑盒,小鼠免疫組化Bax試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液 (Gibco公司)； 胰蛋白酶(Amresco)；實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)SW-CJ-IF(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELDON公司)；恒溫水浴箱(上海儀表廠)；高速離心機(jī)(金壇市科技儀器有限公司)；冰箱(海爾集團(tuán)公司)；顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板(西安舟鼎國(guó)公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN公司生產(chǎn)，型號(hào)：Epcis XL)。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 胃癌(MFC)荷瘤小鼠動(dòng)物模型的建立:細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，將凍存的人胃癌MFC細(xì)胞放入35 ℃水浴內(nèi)進(jìn)行復(fù)蘇。細(xì)胞復(fù)蘇后，以2×106個(gè)/ml 密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長(zhǎng)滿細(xì)胞將培養(yǎng)瓶從CO2培養(yǎng)箱中取出，棄廢液，加入PBS清洗雜質(zhì)3次，用胰酶消化約20 s，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變成透明圓狀時(shí)，加入RPMI1640 培養(yǎng)液停止消化，并用巴氏吸管吹打細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)入離心管，置于離心機(jī)中離心3000 r/min，5 min，去除上清液收集細(xì)胞，備用。

取備用細(xì)胞，調(diào)整懸液濃度為1×107個(gè)/ml，以0.2 ml/只接種于小鼠右側(cè)腋下，接種后觀察接種部位是否出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)及結(jié)節(jié)是否進(jìn)一步增大。

4.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥:將成瘤的小鼠40只分為模型對(duì)照組、扶脾化瘤飲高劑量組、中劑量組及低劑量組，每組10只，接種次日開始給藥，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥14 d。扶脾化瘤飲高、中、低劑量組給藥劑量分別為 6.0、3.0、1.5 g/kg，模型組給予等體積純凈水，自由飲食。實(shí)驗(yàn)前后每天觀察小鼠的活動(dòng)、精神、飲食等情況。

4.3 標(biāo)本制備:停藥次日稱重后脫頸處死小鼠，分離出腫瘤組織，稱重計(jì)算各組小鼠實(shí)體瘤抑制率，將部分組織制作細(xì)胞懸液用作流式檢測(cè)外，其余部分保存于福爾馬林中，制備石蠟切片。

5 觀察指標(biāo)

脫貧攻堅(jiān)，資金是關(guān)鍵。贛州市財(cái)政部門緊扣脫貧攻堅(jiān)任務(wù)，發(fā)揮政府投入主體和主導(dǎo)作用，為全市脫貧攻堅(jiān)提供了有力的資金保障。

5.1 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將部分已剝離腫瘤組織，研磨過濾,用PBS清洗3次后離心重懸，制成瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml ，加入Annexin V 結(jié)合液400 μl 重懸細(xì)胞; 加入AnnexinV-FITC 染色液，輕輕混勻后于4℃ 孵育15 min; 加入7-ADD染色液，混勻，于4 ℃ 孵育5 min。然后加入300 μl Binding Buffer，轉(zhuǎn)入流式管用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

5.2 免疫組化法檢測(cè)Bcl-2、Bax的表達(dá):將石蠟切片常規(guī)脫蠟后,內(nèi)源性過氧化物酶50 μl，37 ℃，10 min；PBS洗3 min，3次;常規(guī)微波處理20 min;蒸餾水漂洗；PBS浸洗5 min，3次;正常動(dòng)物血清50 μl，37 ℃，10 min；一抗50 μl，置濕盒，4 ℃過夜；次日濕盒移入37 ℃孵箱，1～1.5 h；PBS洗5 min，3次；二抗50 μl，37 ℃，30 min；PBS洗3 min，3次；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶50 μl，37 ℃，20 min；PBS洗5 min，3次；DAB顯色液100 μl,光鏡下觀察,控制顯色時(shí)間(3～8 min)；流水充分洗滌，終止顯色反應(yīng)；Bcl-2、Bax作蘇木素復(fù)染5 min左右；脫水、透明、封片。陽性對(duì)照:已知陽性切片。陰性對(duì)照:用PBS緩沖液代替一抗。

5.3 圖像分析與指標(biāo)評(píng)價(jià):顯微鏡下觀察照相，使用專業(yè)圖像分析軟件(BI-2000成都泰盟圖像分析系統(tǒng))進(jìn)行圖像的分析以及處理。根據(jù)分布范圍的不同以及顏色的深淺來確定各目標(biāo)的蛋白量。目標(biāo)選定區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)目越多代表其陽性面積越大；染色顏色越深，陽性信號(hào)越強(qiáng)，其積分光密度(IOD )值越高，最后以IOD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每張切片選取3個(gè)視野，取其平均積分光密度值。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間使用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 扶脾化瘤飲對(duì)MFC胃癌小鼠瘤重的影響 見表1。與模型對(duì)照組比較，扶脾化瘤飲高劑量組的瘤重有明顯降低(P<0.01)，中劑量組的瘤重也有所降低(P<0.05)，小劑量組的瘤重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2 扶脾化瘤飲對(duì)MFC胃癌小鼠瘤細(xì)胞凋亡的影響 見表2。與模型對(duì)照組相比較，隨著扶脾化瘤飲藥物濃度的升高，小鼠細(xì)胞凋亡率顯著增高，初步說明扶脾化瘤飲可能會(huì)誘導(dǎo)小鼠胃癌MFC細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖1)。

3 扶脾化瘤飲對(duì)MFC胃癌小鼠瘤細(xì)胞凋亡基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 見表3。扶脾化瘤飲對(duì)Bax、Bcl-2表達(dá)的影響：與模型組相比，扶脾化瘤飲高劑量組、中劑量組Bcl-2表達(dá)均有顯著下降(P<0.05)，Bax表達(dá)有顯著增高(P<0.01，P<0.05)。

表1 扶脾化瘤飲對(duì)荷人胃癌(MFC)小鼠 實(shí)體瘤的抑制作用

注：與模型組比較,△P<0.01,*P<0.05

4 免疫組化染色 Bcl-2、Bax蛋白陽性染色均位于細(xì)胞漿, 呈清晰棕黃色彌漫性分布(圖2)。

表2 扶脾化瘤飲對(duì)胃癌小鼠(MFC)細(xì)胞凋亡的影響(%)

注：與模型組比較, △P<0.01,*P<0.05

A．模型對(duì)照組 B．扶脾化瘤飲低劑量組 C．扶脾化瘤飲中劑量組 D．扶脾化瘤飲高劑量組

圖1 扶脾化瘤飲對(duì)MFC細(xì)胞凋亡的影響

注：與模型組比較，△P<0.01，*P<0.05

A. Bcl-2陽性表達(dá)高劑量組 B. Bax陽性表達(dá)高劑量組 C.Bcl-2陽性表達(dá)模型組 D. Bax陽性表達(dá)模型組

圖2扶脾化瘤飲對(duì)凋亡基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響(免疫組化染色，×100)

討 論

通常細(xì)胞凋亡有3條通路:死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和線粒體通路。其中Bcl-2、Bax在細(xì)胞凋亡線粒體途徑中均具有重要意義。Bcl-2家族是目前最受重視的與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的一類基因,同屬該家族的抑制凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax可形成一個(gè)凋亡調(diào)節(jié)系統(tǒng)，Bcl-2通過與Bax競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成異源二聚體來抑制細(xì)胞凋亡，二者比例在一定程度上決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。Bax低表達(dá)和Bcl-2高表達(dá)均可使得Bcl-2/Bax 比值升高,細(xì)胞凋亡的敏感性降低,凋亡減少, 為腫瘤細(xì)胞的快速增長(zhǎng), 減慢細(xì)胞的丟失提供優(yōu)勢(shì)條件[3-4]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，扶脾化瘤飲灌胃給藥的MFC小鼠胃癌細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白增多，提示可能通過上調(diào)Bax下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡是多蛋白相互作用、多基因參與調(diào)控過程，目前研究發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡基因主要有caspase家族、p53、Bcl-2家族等[5]。多種抗癌藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,抑制瘤細(xì)胞的增殖作為治療腫瘤的一種重要手段。扶脾化瘤飲可能是通過激活體內(nèi)的多種細(xì)胞因子共同參與細(xì)胞凋亡過程,機(jī)體自身調(diào)節(jié)作用進(jìn)而形成,最終引起靶細(xì)胞的凋亡。

通過大量臨床觀察總結(jié)，機(jī)體的正氣不足伴隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的全過程，扶脾化瘤飲以益氣扶正、化痰散結(jié)為法，最終達(dá)到治療的目的。中醫(yī)藥是腫瘤治療領(lǐng)域的一大特色[6-10]，深入研究中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，有助于為中藥抗腫瘤研究提供更客觀、更科學(xué)的方法。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)、文化的發(fā)展，生活水平和生活質(zhì)量的逐步提高，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的思考模式和治療模式越來越注重心理因素和社會(huì)因素層面的考量，對(duì)生存的概念，隨著醫(yī)學(xué)模式及生物社會(huì)心理醫(yī)學(xué)模式的發(fā)展和轉(zhuǎn)變，除了進(jìn)行手術(shù)、放療、化療等治療方案以外，更強(qiáng)調(diào)提高患者術(shù)后及病情控制后的生存質(zhì)量。這與中醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐強(qiáng)調(diào)整體觀念，注重人文關(guān)懷，注重患者主觀滿意度的傾向與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的模式不謀而合，因此中藥控制治療癌癥具有重要的研究意義。