桂枝附子含藥血清對類風濕關節炎模型的影響

簡旖沫 湯小虎 賴張鳳

摘要：目的?通過液質聯用（LC-MS）技術分析桂枝附子溫通經脈配伍灌胃后膠原關節炎（CIA）大鼠的血清移行成分，考察桂枝附子含藥血清對類風濕關節炎模型的影響。方法?選取雄性Wistar大鼠25只隨機取6只分為正常組、桂枝附子組，每組3只，其余大鼠采用Ⅱ型膠原造模。將造模成功的6只CIA大鼠隨機平均分為模型組、造模桂枝附子組，每組3只。予20倍給藥劑量的桂枝附子配伍灌胃給藥，正常組和模型組大鼠予生理鹽水灌胃，60 min后經肝門靜脈取血，采用甲醇沉淀法處理血清，予LC-MS技術對其進行分析。通過將含藥血清與相同條件下測定的模型組血清、正常組血清、供試品以及對照品圖譜比較，分析大鼠給藥后血清中的移行成分。結果?桂枝附子組含藥血清中產生了10個移行成分，均為代謝產物;造模桂枝附子組含藥血清產生了25個移行成分，其中8個為原形成分，17個為代謝產物。結論?造模后大鼠的含藥血清中移行成分明顯增加，成分濃度也較高。由此可見，CIA大鼠病理模型選擇性的吸收了桂枝附子含藥學清中的成分，從基礎層面探討中醫“有是病用是藥”理論。

關鍵詞：CIA病理模型;類風濕關節炎;桂枝附子;含藥血清;LC-MS

中圖分類號：R255.6?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2019）04-0069-05

風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性、侵蝕性、全身性的自身免疫疾病，其基本病理改變為對稱性的關節滑膜炎，血管翳形成，并逐漸出現關節軟骨和骨質的侵蝕與破壞，最終可導致關節畸形和功能喪失。目前治療RA的常用藥物為非甾體類抗炎藥、糖皮質激素類和慢作用抗風濕藥等，這些藥物的毒副作用較大，而生物制劑則價格昂貴。結合我國幾千年中醫藥治療風濕病的特色，及云南吳佩衡扶陽學術思想，以溫陽通絡法治療風濕病為切入點，開展中醫藥防治風濕病，對提高人民群眾健康水平具有重要的意義。通過臨床實踐及實驗研究發現，溫陽通絡法對風寒濕痹的臨床癥狀有明顯改善，可顯著降低CRP、ESR、RF滴度等指標。其中桂枝、附子做為主要藥物，具有溫經通陽、散寒除濕之功，發揮著蠲痹止痛之效。藥物經口服后通過消化道直接吸收入血，或經消化酶及腸內菌群的分解成代謝產物被吸收入血。中藥的有效物質最終都會以血液為媒介輸送到不同的作用靶點發揮藥效。本課題通過液質聯用技術（LC-MS）分析桂枝、附子以及桂枝附子溫通經脈配伍灌胃后膠原關節炎（CIA）大鼠的血清移行成分，考察含藥血清對CIA大鼠模型的影響，建議入血色譜圖，進一步探討桂枝附子配伍灌胃后的入血藥效物質基礎以及配伍環境的相互作用，從而為桂枝附子溫通經脈配伍抗RA提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?實驗動物?雄性Wistar大鼠25只，SPF級，體重（200±20）g;由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物使用許可證號SCXK（川）2013-24。

1.2?實驗藥材于與試劑?中藥材桂枝、附子由云南省中醫醫院中藥房提供。牛Ⅱ型膠原，四川大學;完全弗氏佐劑（263810，BD公司）;苯甲酰新烏頭原堿63238-67-5、苯甲酰烏頭原堿466-24-0、苯甲酰次烏頭原堿63238-66-4、桂皮醛89Z9-G2NP、對甲氧基桂皮酸乙酯XW99-CWBR、肉桂酸VUZS-DKSH，均來自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、三氯乙酸、冰醋酸等。

1.3?實驗儀器?Waters Xevo TQD三重四極桿液質聯用儀，美國Waters公司;Agilent1100 高效液相色譜儀，美國Agilent公司;AL 204萬分之一分析天平，瑞士Metter T-oledo公司;Biofuge Primo R 離心機，德國Thermo ScientificHeraeus公司;YLS-7B足趾容積測量儀，濟南益延科技發展有限公司。

1.4?醇提浸膏的制備

1.4.1?附子醇提浸膏的制備?取附子藥材飲片，打粉過60目篩，精密稱定600 g，置圓底燒瓶中，按料液比1：10（g/mL）加入95%乙醇，于超聲清洗器中振蕩提取50min，浸泡1天，回流提取2h，提取2次，過濾，合并提取液，測定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，滅菌后置低溫處保存備用[1-2]。

1.4.2?桂枝醇提浸膏的制備?取桂枝藥材飲片，打粉過60目篩，精密稱定600 g，置圓底燒瓶中，按料液比1：10（g/mL）加入95%乙醇，熱回流提取2 h，連續3次，合并濾液，測定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，滅菌后置低溫處保存備用[3]。

1.5?含藥血清和空白血清的制備?選取Wistar大鼠25只，隨機選取4只平均分為正常組和桂枝附子組，每組2只，剩下21只造CIA大鼠模型。造模后21天的大鼠采用關節炎分數評分法計算關節炎指數。將造模成功后的4只大鼠隨機平均分為模型組和造模桂枝附子組，每組2只。根據云南扶陽流派臨床常用生藥劑量（桂枝20 g，制附子30 g）的20倍給藥，按“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算出大鼠等效劑量，即實驗組大鼠相當給生藥量為90 g·kg-1。桂枝附子組以及造模桂枝附子組予桂枝附子配伍灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，給藥容積為1 mL/100 g。給藥前將大鼠禁食12 h，使大鼠處于空腹狀態，以促進藥物的吸收。灌胃后60 min于肝門靜脈取血0.5 mL，待血液凝固后，置離心機于4 ℃，12000 r，3 min離心后分離血清，同組血清合并，用甲醇沉淀法對血清進行處理。造模評價方法：致炎后第21天采用關節炎分數評分法計算關節炎指數。0級：無紅斑或腫脹，0分;I級：輕微的紅斑和一個趾關節腫脹，1分;II級：紅斑和超過一個趾關節的腫脹，2分;III級：紅斑和踝部或腕部腫脹，3分;IV級：全部紅斑以及腳趾和踝部或手指和腕部的腫脹，踝或腕不能彎曲，4分;4只肢體關節腫脹級之和（最高分為16分）即為大鼠關節炎指數，大鼠關節炎指數≥2為造模成功的標準。7天/次，共4次。

1.6?供試品的制備?精密稱取附子、桂枝浸膏1 g，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

1.7?對照品溶液的制備?分別精密稱定桂皮醛對照品、肉桂酸對照品、對甲氧基桂皮酸乙酯對照品、苯甲酰新烏頭原堿對照品、苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，精密稱定，加入甲醇制備成每1 mL含10μg的溶液。

1.8?檢測條件

1.8.1?色譜條件?ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱;水為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫程序為甲醇的濃度梯度 1%（0-1.0 min），1.0%-3.0%（1.0-1.5 min），3.0%-32%（1.5-13.5 min），32%-60%（13.5-18.5 min），60%-90%（18.5-20.5 min）進行梯度洗脫;柱溫25度，流速5μL/min;測波長分別為242 nm、254 nm、265 nm、290 nm及320 nm。

1.8.2?質譜條件?電噴霧離子源（正負離子掃描）;正離子掃描為3000 V，負離子掃描為2800 V，離子源溫度為110 ℃，霧化氣流量為150 L/h，脫溶劑氣流量為600 L/h，脫溶劑溫度為250 ℃，毛細管電壓錐孔電壓為35 V，微通道板電壓為2700 V，碰撞氣為氬氣，碰撞能為4 V;每0.1s采集一次譜圖;亮氨酸-腦啡肽（leucine-enkephalin，[M+H]+=556.2771;[M-H]-=554.2615）溶液校正質量，進樣速度為100 μL/min，頻率為5 s;采用全掃描方式，掃描范圍m/z100～1000Da。

1.9?測定與方法學考察?分別吸取含藥血清、空白血清、供試品溶液、對照品溶液各10μL，注入高效液相色譜質譜儀，予液質聯用法（LC-MS）對血清進行檢測分析。通過記錄桂皮醛對照品、肉桂酸對照品、對甲氧基桂皮酸乙酯對照品、苯甲酰新烏頭原堿對照品、苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品以及空白血清的色譜圖，觀察相同保留時間處空白血清色譜圖中是否檢測出對照品的色譜峰。結果顯示對照品及大鼠血清內源性物質均實現基線分離，且在對照品色譜峰的“信號窗”（信號附近的有限范圍）內沒有出現內源性物質信號的干擾。

2?實驗結果

通過對比含藥血清與正常組空白血清的圖譜，篩選出有差異化合物峰，即為桂枝、附子灌胃后血中移行成分;通過對比含藥血清中的移行成分與桂枝、附子供試品的圖譜，篩選相同的化合物峰，即為被吸收的原型成分，在中藥供試品圖譜中沒有被檢測到的化合物峰即為代謝產物[4]。通過分析相關圖譜，考察類風濕關節炎造模對中藥灌胃后大鼠血清中移行成分的影響。

進樣14 min～18 min正離子模式下造模桂枝附子組、桂枝附子組以及正常組的血清質譜圖。通過質譜圖的對比，在造模桂枝附子組的血清中檢測到離子峰m/z409.2與m/z425.2，m/z429.3，m/z452.2。桂枝附子組的血清中檢測到離子峰m/z318.3，m/z362.4與m/z384.4。

同理，通過對比0 min～2 min，2 min～6 min，6 min～10 min，10 min～14 min，14 min～18 min以及18 min～22 min的正、負離子模式下造模桂枝附子組、桂枝附子組、正常組的血清以及桂枝、附子供試品相同時段質譜圖，結果顯示CIA大鼠灌胃桂枝附子配伍后含藥血清中產生了25個移行成分，其中8個為中藥原形成分，其余17個為代謝產物;正常大鼠灌胃桂枝附子后含藥血清中產生了10個移行成分，均為代謝產物。見表1、表2。

3?討論

中醫辨病論治的理論由來已久。《黃帝內經》早有熱論、咳論、痿論、痹論、厥論、風論、瘧論、癲狂等病名的記載，而“內經十三方”也提及的相應疾病，如生鐵落飲治療狂證，雞矢醴治療臌脹，蘭草湯治療脾癉等等[5]。《諸病源候論》、《神農本草經》、《千金要方》以及《三因極一病證方論》等古籍也有關于辨病論治的闡述。明清時期醫家喻嘉言曰：“有是病用是藥，病千變，藥亦千變”;“故治病必先識病，識病然后議藥，藥者所以勝病者也。識病，則千百藥中，任舉一二種用之且通神;不識病，則歧多而用眩。”辨識疾病是治療疾病的首要任務和方法。近代著名醫家岳美中指出“有是病即用是藥，故一病有一病之專方……不能辨病，焉能識證，不能用方，焉能施治”，同樣強調了辨病論治的重要性。疾病是機體在一定病因作用下，因自穩調節紊亂而發生的異常生命活動過程。由于生理與病理狀態下機體對藥物的吸收分布不同，隨之產生的藥效物質成分也不同，而這些差異很大程度上影響中藥的藥效的發揮。本實驗采用血清藥化學方法，通過分析比較模型組與非模型組含藥血清成分，考察桂枝附子含藥學清對CIA大鼠病理模型的影響，探討中醫“有是病用是藥”以及“有故無殞，亦無殞”的理論基礎。

中藥以及中藥復方是一個巨大而復雜的系統，其藥效的發揮是多種化學成分相互作用產生的綜合效果[6]。中藥的有效物質最終都會以血液為媒介輸送到不同的作用靶點從而發揮藥效[7]。20世紀90年代初王喜軍教授提出了“中藥血清藥物化學”理論及研究內容，研究結果不僅揭示中藥藥效物質基礎，也為解析方劑配伍規律、闡釋中藥藥理學特性等中醫藥研究提供了科學有效的方法。本課題利用CIA大鼠模型模擬人類類風濕關節炎，從藥物吸收情況考察桂枝附子含藥血清對類風濕關節炎模型的影響，從而驗證了中醫“有是病用是藥”的理論基礎。CIA大鼠發病機制主要是由Ⅱ型膠原活化的T細胞和巨噬細胞早期侵入滑膜內層，局部釋放炎性因子，隨著粒細胞等侵入，共同形成血管翳[8]。破骨細胞和膠原酶的介入最終導致骨結構的喪失，自愈再發的反復過程中新生骨的形成，致使關節變形和僵硬。CIA大鼠膝、踝關節可見明顯的滑膜細胞增生、毛細血管增生以及炎細胞浸潤與關節軟骨面剝脫，這些表現接近人類的類風濕關節炎[9]。相關報道顯示殷飛等通過觀察正常大鼠、病理狀態的大鼠清肝化瘀方藥含藥血清對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響，結果顯示病理狀態下大鼠的血清對肝癌細胞有明顯的抑制作用[10]。呂濤等用40%CCl4皮下注射9周制備大鼠肝纖維化模型，運用HPLC檢測正常、肝纖維化大鼠分別灌服黃芪后血清中的黃芪甲苷含量，結果病理大鼠含藥血清中的黃芪甲苷含量高于正常大鼠含藥血清[11]。由此可見，病理狀態下的機體對藥物的吸收有促進作用。正常生理狀態下的動物血清能在一定程度上避免疾病機體對體內藥物有效成分的“消耗”，從而導致正[FQ（21*1。175mm，X，DY-W]常動物血清中的有效成分與病理狀態的有所差異[12]。由于生理與病理狀態下機體對藥物的吸收轉化不同，產生的內源性活性成分及其濃度也有所不同。本實驗結果顯示CIA大鼠的含藥血清產生了25個移行成分，其中8個為原形成分，17個為代謝產物;而未造模大鼠含藥血清只產生10個移行成分，CIA大鼠的含藥血清濃度也較未造模的高。由此可見類風濕關節炎模型促進了桂枝附子配伍有效成分的吸收。故病理狀態下制備的中藥含藥血清更有利于中藥藥效的發揮，其結果也更加真實、可靠。這也從基礎層面驗證了中醫“有是病用是藥”的理論，這不僅為中醫藥現代化、國際化提供了一定的途徑，也而為更好的指導臨床提供了理論基礎。

參考文獻：

[1]鄭燕影，魏群利.中藥復方消可寧附子總生物堿的醇提工藝[J].中國生化藥物雜志，2012，3：248-250.

[2]劉卓，晏星，徐春霞，等.附子總生物堿的提取工藝研究[J].安徽農業科學，2012，9：5199-5201.

[3]高曉霞.桂枝茯苓膠囊的代謝組學與藥代動力學研究[D].沈陽藥科大學，2009.

[4]王喜軍.中藥血清藥物化學[M].北京：科學出版社，2010：285.

[5]張慶祥.辨病論治與辨證論治關系探析[J].遼寧中醫雜志，2005，2：107-108.

[6]Yang W Z，Ye M，Qiao X，et al.A strategy for efficient discovery of new natural co-mpounds by integrating orthogonal column chromatography and liquid chromatography/mass spectrometry analysis：its application in Panax ginseng，Panax quinquefoliumand Panax noto-ginseng to characterize 437 potential new ginsenosides[J].Anal Chim Acta，2012，739：56.

[7]雷志丹，雷志鈞，夏新華.川芎血清藥物化學的初步研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，12：96-98.

[8]張星華，杜小正，王金海，等.類風濕關節炎動物模型在中醫藥研究中的進展[J].亞太傳統醫藥，2015，13：47-50.

[9]趙宏艷，王燕，肖誠，等.不同品系、不同性別對大鼠CIA發病情況的比較研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，2010，09：761-764.

[10]殷飛，姚樹坤，吳新滿，等.清肝化瘀方藥含藥血清對肝癌細胞SMMC-7721增殖和凋亡的影響[J].中藥藥理與臨床，2004，20（3）：30.

[11]呂濤，姚希賢，孫澤明.藥物血清內黃芪甲苷含量測定及其抑制HSCs活化增殖的實驗研究[J].中華中醫藥學刊，2011，12：2770-2773.

[12]韓笑，劉建勛，林成仁.血清藥理學關鍵問題的存疑與討論[J].中藥藥理與臨床，2009，25（2）：122-124.