七氟醚對阿爾茨海默癥小鼠模型學習記憶的影響研究

黃柯冰，趙 飛，陶維初，李鳳仙

阿爾茨海默病（AD）的早期癥狀為短期記憶喪失，隨著病情的惡化，語言、方向感、情緒、行動等能力喪失，生活無法自理，行動障礙[1]，最終導致死亡。患者確診后的平均預期壽命為3～9年[2]，嚴重危害人體健康。AD的病理學特點為大腦皮層和特定的皮層區域中神經元和突觸功能喪失，組織萎縮，如顳葉、頂葉、額葉皮層和扣帶回等腦區的退化[3]。七氟醚是一種吸入性的全身麻醉劑，具有帶甜味、不易燃、揮發性和起效快等特點[4]。電生理學研究顯示，七氟醚可作為γ-氨基丁酸受體的正向變構調節劑調節神經元功能[5]，也可作為天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑增強甘氨酸受體電流，并抑制乙酰膽堿和5-羥色胺受體電流[6]。雖然七氟醚具有神經調節作用，但其對AD小鼠學習記憶的影響及機制尚未闡明。因此，本課題主要研究七氟醚對AD小鼠學習記憶的影響，并試圖探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 30只雄性C57BL/6小鼠[西安交通大學醫學院實驗動物中心，SCXK(陜)2017-003]，體重（25±2）g。分籠飼養，每籠5只。動物房維持溫度（22±2）℃，濕度（54±2）%，12 h 光照與黑暗交替，自由飲食飲水。將小鼠隨機分為3組：對照組、模型組和七氟醚組，各10只。

1.2 AD小鼠模型的建立 參照石成男等[7]的方法建立AD小鼠模型：對模型組和七氟醚組腹腔注射 120 mg/(kg·d)D-半乳糖和 90 mg/(kg·d) 亞硝酸鹽，連續6 w；對照組給予同劑量的生理鹽水。

1.3 麻醉方法 七氟醚組在建模6 w后，采用自制麻醉箱（40 cm×15 cm×15 cm）進行七氟醚吸入麻醉。麻醉箱有2個側孔，一側接麻醉機，另一側接氣體監測儀。調節揮發罐使箱內七氟醚的濃度維持在3%，氧氣流量為 2 L/min，維持溫度為（37±1）℃，持續4 h。然后取出小鼠，在恢復正常反射后，放入原先的鼠籠中。對照組和模型組在相同條件下，在麻醉箱中吸入流量為2 L/min的氧氣。

1.4 Morris水迷宮實驗 各組分別于麻醉結束后1、2、3、4、5 和 6 d，進行水迷宮實驗，分為前 6 d 的定位航行實驗和第7 d的空間探索實驗。水迷宮為一個直徑180 cm、深60 cm的圓形黑金屬槽，槽內注水，水深 40 cm，溫度（24±2）℃。 將攝像機安裝在槽上的天花板上，并與裝有分析管理系統的電腦相連。水迷宮被劃分為4個象限，在一個固定象限放置平臺，平臺沒于水下2 cm。定位航行實驗共訓練4次，分別于4個入水點將小鼠面壁放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺的時間，作為逃避潛伏期。如果小鼠在120 s還未達到平臺，則由實驗者將小鼠引至平臺，時間記為120 s，取4次訓練的均值。第6 d的定位航行實驗結束后移除平臺，于第7 d進行空間探索實驗。將小鼠于移除平臺象限的斜對角象限的中點背向池壁放入水中，記錄小鼠在120 s內于平臺象限中的滯留時間及穿越平臺位置的次數。平臺象限滯留時間比(%)=平臺象限滯留時間（s）/120（s）×100%。

1.5 實時定量PCR 水迷宮實驗結束后，小鼠斷頭處死，迅速分離腦組織，于冰塊上取海馬、前額葉皮層、杏仁核和小腦，儲存于-80℃備用。用TriZol試劑（美國Invitrogen公司）提取各腦區中的RNA，取1 μg RNA用TaqManTM反轉錄試劑盒合成cDNA（美國 Invitrogen公司）,采用 SYBR GreenⅠ（美國Invitrogen公司）進行實時定量PCR擴增，GAPDH為內參。引物由Primer Designing Tool在線軟件設計（表1）。采用實時定量PCR檢測GluR1、PSD95、GRP78、elF-2和PERK mRNA的表達水平。

2 結果

2.1 各組逃避潛伏期比較 模型組的逃避潛伏期從訓練第1 d開始長于對照組；訓練第4 d前，七氟醚組的逃避潛伏期與模型組比較均無顯著差異（P>0.05），而從訓練第4 d開始長于模型組（P<0.05，圖1）。提示七氟醚可加劇AD小鼠的學習記憶損傷。

2.2 各組空間探索能力比較 與對照組相比，模型組平臺象限滯留時間和平臺象限滯留時間百分比降低，穿越平臺的次數均增加（P<0.05）；與模型組對比，七氟醚組的平臺象限滯留時間和平臺象限滯留時間比降低，穿越平臺的次數均增加（P<0.05）。提示七氟醚可加重AD小鼠的空間探索能力障礙。見表2。

表1 引物序列

圖1 比較各組逃避潛伏期（n=10）

2.3 各組各腦區GluR1和PSD95 mRNA的表達水平比較 除各組杏仁核PSD95的表達無顯著差異外，模型組GluR1和PSD95在各腦區中表達均低于對照組，而七氟醚組均低于模型組（P<0.05），提示七氟醚可促進AD小鼠大腦神經元突觸功能障礙。見圖2。

2.4 各組各腦區GRP78、elF-2和PERK mRNA表達水平比較 模型組各腦區中GRP78、eIF-2和PERK的表達均高于對照組，而七氟醚組均高于模型組 （P<0.05），但七氟醚組杏仁核中eIF-2的表達、前額葉皮層和小腦中PERK的表達與模型組比較無顯著差異（P>0.05），提示七氟醚可促進AD小鼠各腦區中內質網應激。見圖3。

3 討論

七氟醚是一種廣泛用于兒科麻醉的吸入麻醉藥，具有安全、起效快、恢復時間短等優勢。但七氟醚可誘導嬰兒神經元凋亡，并抑制新神經元的產生[8]。研究表明，早期接觸七氟醚可能會呈劑量依賴式損害成年期的空間記憶，且4%的七氟醚引起的空間記憶損傷將可維持4 w[9]。七氟醚可誘導正常小鼠和孕鼠的神經元凋亡，促進淀粉樣蛋白的聚集，進而參與AD的病理過程[10]。但也有相反的研究表明，接受七氟醚麻醉的年輕鼠和老年鼠的學習記憶功能均沒有損傷[11]。

逃避潛伏期反映受試動物的學習能力，潛伏期越短，其學習能力越強。空間探索能力反映的是受試動物的空間記憶的保持能力，受試動物在原平臺象限滯留時間越長，其記憶能力越強。本研究將AD小鼠暴露于3%的七氟醚中4 h后，采用水迷宮實驗檢測小鼠的學習記憶能力及空間探索能力，發現七氟醚可進一步延長AD小鼠的逃避潛伏期，降低小鼠在平臺上的滯留時間。表明七氟醚可延長小鼠爬上平臺花費的時間，減少小鼠在平臺象限的滯留時間，即便在訓練幾天后這種情況依然沒有改變，表示七氟醚加劇AD小鼠的學習記憶能力損傷。

突觸蛋白的表達與突觸可塑性、突觸結構的改變以及突觸傳遞有關。GluR1不僅是谷氨酸受體，還是陽離子通道，是許多突觸后膜上突觸可塑性和突觸傳遞的不可缺少的分子[12]。突觸后膜GluR1上調的潛在生理學機制與興奮性突觸后電位（EPSP）的增加有關，可導致EPSP持久增加，誘導長時程增強（LTP），增加學習記憶功能[12]。本研究表明，七氟醚可降低AD小鼠各腦區中GluR1的表達，可能是其損傷AD小鼠學習記憶功能的作用機制之一。PSD95是一個突觸后標記物，其下調可打亂突觸結構[13]。本研究發現，七氟醚降低AD小鼠海馬、前額葉皮層及小腦中PSD95的表達，提示七氟醚可能會破壞突觸結構及突觸傳遞，損傷學習記憶功能。

表2 各組空間探索能力比較（n=10）

圖2 各組各腦區GluR1和PSD95 mRNA的表達水平比較

圖3 各組各腦區GRP78、elF-2和PERK mRNA表達水平比較

GRP78為內質網應激的關鍵生物標記分子，當錯誤折疊的蛋白質積累時，GRP78釋放，使跨膜信號蛋白聚集，并引發內質網應激[15]。PERK為一個跨膜轉運信號分子，eIF-2為PERK通路上的關鍵分子[16]。內質網應激可降低大鼠BDNF和突觸素的表達[17]，提示內質網應激對突觸功能的負向調控。研究表明，七氟醚可通過調控肌醇-1,4,5-三磷酸肌醇受體和魚尼丁受體將Ca2+從內質網釋放至胞質，可影響神經元鈣穩態[14]。然而，七氟醚是否可誘導AD小鼠神經元內質網應激還未可知。本研究顯示，七氟醚可增加AD小鼠各腦區中GRP78、eIF-2和PERK的表達，表明內質網應激可能在七氟醚損傷AD小鼠學習記憶中起關鍵作用。由此可以推斷，七氟醚可誘導小鼠各腦區中的內質網應激，導致突觸功能障礙，進一步損傷AD小鼠的學習記憶功能。

總之，七氟醚可降低AD小鼠的學習記憶功能，其機制可能與影響小鼠各腦區突觸功能，使內質網應激增加有關。