哮喘寧顆粒對哮喘大鼠Th1/Th2平衡和STAT1通路調節作用的研究

單敏敏 李長安 崔紅生

[摘要] 目的 觀察中藥復方哮喘寧顆粒對Th1/Th2平衡和STAT1通路的影響，探討其抗哮喘的作用機制。 方法 SPF級雄性SD大鼠40只，采用數字隨機法將其隨機分成5組，正常組、哮喘組、IL-27預防組、哮喘寧顆粒組和哮喘寧顆粒+Fludarabine（STAT1抑制劑）組，每組8只，采用卵白蛋白聯合氫氧化鋁腹腔注射致敏和卵白蛋白滴鼻激發的方法建立哮喘模型大鼠。各組分別于致敏前階段采用IL-27滴鼻預防（IL-27預防組），或激發階段灌胃哮喘寧顆粒進行治療（哮喘寧顆粒組），或合并腹腔注射STAT1抑制劑Fludarabine觀察效果。各組均于最后一次激發后處死大鼠，收集血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF），ELISA檢測白細胞介素4（IL-4）和γ干擾素（IFN-γ）表達含量，Western blot檢測肺組織pSTAT1（STAT1磷酸化蛋白）、信號轉導與轉錄激活因子1（STAT1）蛋白表達水平。結果 與哮喘組模型大鼠比較，哮喘寧顆粒組和IL-27預防組大鼠血清和BALF中IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯上升（P < 0.05），與哮喘寧顆粒組大鼠比較，Fludarabine抑制了哮喘寧顆粒的治療作用（P < 0.05）。與哮喘組模型大鼠比較，哮喘寧顆粒組和IL-27預防組大鼠肺組織中pSTAT1的蛋白表達水平明顯升高（P < 0.05），與哮喘寧顆粒組大鼠比較，Fludarabine抑制pSTAT1蛋白的表達（P < 0.05）。 結論 哮喘寧顆粒能有效改善哮喘大鼠體內的Th1/Th2失衡，并上調受抑制的pSTAT1蛋白水平，增加STAT1通路的磷酸化，其治療哮喘的機制可能通過與IL-27誘導的STAT1磷酸化通路相關。

[關鍵詞] IL-27通路；哮喘寧顆粒；支氣管哮喘；Th1/Th2；STAT1磷酸化

[中圖分類號] R256 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（a）-0011-05

Protective effect of Xiaochuangning Granules on Th1/Th2 balance and STAT1 phosphorylation in asthma rats

SHAN Minmin1 LI Changan2 CUI Hongsheng3

1.Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2.Department of Pulmonary Disease，Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 3.Department of Pneumology， the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100029， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Xiaochuangning Granules on Th1/Th2 balance and STAT1 pathway in asthma， and to explore its anti-Xiaochuangning mechanism. Methods Fourty SPF male SD rats in total， using the digital random method randomly divided into 5 groups， the normal group， asthma group， IL-27 prevention， Xiaochuangning Granules group and the asthma rather pellet + Fludarabine （STAT1 inhibitors） group， each group of eight rats， were established by intraperitoneal injection of ovalbumin joint aluminum hydroxide sensitization and intranasal ovalbumin excitation method were established. Each group was treated with IL-27 nasal drops （IL-27 prevention group） in the pre-sensitization stage， or by gavage of Xiaochuangning Granules （Xiaochuangning Granules group） in the excitation stage， or combined with intraperitoneal injection of the STAT1 inhibitor Fludarabine to observe the effect. Rats in each group were sacrificed after the last stimulation， serum and BALF were collected， the expression levels of IL-4 and IFN-γ were detected by ELISA， and the expression levels of pSTAT1 （STAT1 phosphorylated protein）， signal transduction and transcriptional activator 1 （STAT1） in lung tissues were detected by Western blot. Results Compared with the model rats in asthma group， the IL-4 contents in serum and BALF were significantly decreased and the IFN-γ contents were significantly increased in Xiaochuangning Granules group and IL-27 prevention group （P < 0.05）. Compared with Xiaochuangning Granules group， Fludarabine inhibited the therapeutic effect of Xiaochuangning Granules （P < 0.05）. Compared with the asthma group model rats， the expression level of pSTAT1 protein in the lung tissues of the Xiaochuangning Granules group and the IL-27 prevention group was significantly increased （P < 0.05）， and Fludarabine inhibited the expression of pSTAT1 protein in the lung tissues of the Xiaochuangning Granules group （P < 0.05）. Conclusion Xiaochuangning Granules can effectively improve Th1/Th2 imbalance in Xiaochuangning rats， and up-regulate the level of inhibited pSTAT1 protein and increase the phosphorylation of the STAT1 pathway. The mechanism of asthma treatment may be related to the IL-27 induced phosphorylation of the STAT1 pathway.

[Key words] Interleukin-27 pathway； Xiaochuangning Granules； Bronchial asthma； Th1/Th2； STAT1 phosphorylation

支氣管哮喘（簡稱哮喘）患病率逐年上升，全世界至少有3億患者，我國至少有3000萬患者[1]。在我國的一項“全國支氣管哮喘患病情況及相關危險因素流行病學調查”（China Asthma and Risk Factors Epidemiologic Investigation，CARE研究）發現，我國的哮喘患病率達到1.24%[2]。哮喘寧顆粒是武維屏教授基于調肝理肺思路研制的治療支氣管哮喘的經驗方，該方臨床應用30余年，效果顯著，本課題組既往臨床研究[3]表明，哮喘寧顆粒治療支氣管哮喘的控顯率和總有效率分別達到63.33%和90.00%。從病理機制分析，哮喘是一種免疫性疾病，Th（T helper lymphocyte cells，輔助性T淋巴細胞）亞群Th1/Th2的細胞失衡是哮喘免疫學發病的基礎[4]，基于白細胞介素-27（IL-27）通路對Th細胞免疫平衡的調節作用，提出“哮喘寧顆粒通過調控IL-27通路從而達到調節哮喘Th1/Th2免疫失衡，減輕氣道炎性反應”的科學假說。本項目建立在既往研究工作基礎上，通過哮喘寧顆粒干預哮喘模型大鼠，與其余各組比較，采用支氣管肺泡灌洗、ELISA、WB等技術與方法，分別對該模型的支氣管肺組織、支氣管肺泡灌洗液等進行深入研究，揭示哮喘寧顆粒在IL-27通路調控中的作用靶點，闡明哮喘寧顆粒通過IL-27通路調節支氣管哮喘Th1/Th2免疫平衡的作用機制，為其臨床應用提供客觀實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠40只，3～4周齡，雄性，體重（120±10）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[許可證編號SCXK（京）2016-0011]，常規飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，12 h光照和夜循環，溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%。

1.2 主要試劑

哮喘寧顆粒（北京中醫藥大學東直門醫院制劑室生產，12 g/袋，批準文號：京藥制字Z20053078，產品批號：1807060）。卵蛋白（OVA，V級，批號：RH42844）購自美國Sigma公司。氫氧化鋁佐劑（廠家Adjuvants-Alum，Pierce，生產批號：77161）；重組人IL-27（Proteintech公司，生產批號：HZ-1275）；特異性STAT1抑制劑（Fludarabine，Bioruler，生產批號：RJ1179）；β-atin單克隆抗體（Cell Signaling，生產批號：4970S）；γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒（liuhe biotech公司，生產批號：LH-E10096RA）；IL-4 ELISA試劑盒（liuhe biotech公司，生產批號：LH-E10102RA）；IFN-γ抗體（Affinity公司，生產批號：DF6045）；PSTAT1（Affinity公司，生產批號：AF3449）；STAT1抗體（Proteintech公司，生產批號：10144-2-AP）；IL-4抗體（Proteintech公司，生產批號：66142-1-IG-150）均購自北京百諾威生物科技有限公司。eECL Western Blot Kit高靈敏度化學發光檢測試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，生產批號：CW0049）；PVDF 膜購自Millipore公司。

1.3 實驗分組及治療方案

大鼠經適應性喂養1周后，采用隨機數字法將其分為5組，每組8只，分別為正常組、哮喘組、IL-27預防組、哮喘寧顆粒組和哮喘寧顆粒+Fludarabine組，參照文獻[5]建立大鼠哮喘模型。

1.3.1 哮喘組 于實驗第l、7天向大鼠腹腔注射含OVA（100 mg）、氫氧化鋁（100 mg）的混合液1 mL致敏，第15天每天1% OVA滴鼻激發，每天1次，連續7 d，末次激發后次日處死大鼠。

1.3.2 IL-27預防組 于實驗前7 d至實驗第7天，在大鼠麻醉狀態下（異氟烷吸入性麻醉），鼻腔滴入IL-27溶液，每日2次，每次200 ng；其余操作同哮喘組。

1.3.3 哮喘寧顆粒組 實驗第15天開始，每天激發前2 h給予哮喘寧顆粒2.18 g/kg 灌胃，每日1次，連續7 d；其余操作同哮喘組。

1.3.4 哮喘寧顆粒+Fludarabine組 實驗第15天開始給予哮喘寧顆粒時，同時腹腔注射80 mg/kg Fludarabine[溶解于無菌磷酸鹽沖溶液（PBS）中]，每日1次，連續7 d；其余操作同哮喘寧組。

1.3.5 正常組 致敏和激發均以0.9%生理鹽水，流程同哮喘組。

1.4 實驗方法

于實驗第21天末次激發后次日，將大鼠用水合氯醛腹腔麻醉處死后，按照下述方法進行取材：

1.4.1 血清取材 各組大鼠剖腹后，分離腹主動脈取血，經37℃水浴15 min至凝，1500 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，分離血清，-80℃冰箱保存。

1.4.2支氣管肺泡灌洗液（BALF）取材 分離取出完整的氣管、支氣管和肺組織，結扎左側主支氣管，于右肺進行氣管插管肺泡灌洗，每次注入2 mL生理鹽水，抽吸3次后收集液體；重復3次；經1500 r/min離心10 min，離心半徑13.5 cm，上清液于-80℃冰箱保存。

1.4.3肺組織取材 分別取右側支氣管肺組織，稱重，按照質量/體積比例為10，加入裂解液，真空勻漿裂解后，經3000 r/min低溫離心10 min，上清液于-80℃冰箱保存。

1.5 ELISA 檢測IL-4和IFN-γ表達水平

根據廠家說明書，嚴格按照實驗流程檢測血清和BALF中IL-4和IFN-γ的表達水平。

1.6 Western blot檢測pSTAT1和STAT1蛋白水平

蛋白上清液用考馬斯亮藍方法檢測總蛋白含量，加入SDS loading buffer煮沸5 min，取50 mg蛋白上樣，10%SDS PAGE分離總蛋白并電轉移至硝酸纖維素膜（PVDF）上；用脫脂奶粉封閉PVDF膜后，用1∶1000稀釋倍數的pSTAT1、STAT1和GAPDH抗體（均用TBST稀釋）雜交，TBST反復清洗3次后，用1∶5000稀釋倍數的羊抗IgG雜交，TBST反復清洗3次后，超敏ECL化學發光顯像，凝膠圖像分析系統掃描各蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內參蛋白。

1.7 統計學方法

采用SPSS16.0軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，各組數據采用One-way ANOVA分析，進一步組間兩兩比較采用Tukey法進行，以P < 0.05作為差異統計學有意義。

2 結果

2.1 五組血清和BALF中IFN-γ及IL-4水平的比較

末次激發后次日，與正常組大鼠比較，哮喘組大鼠血清和BALF的IL-4水平顯著增加（P < 0.01），IFN-γ水平顯著降低（P < 0.01），證明復制出哮喘大鼠模型，出現Th1/Th2失衡。與哮喘組大鼠比較，IL-27預防組和哮喘寧顆粒組大鼠血清和BALF的IL-4水平均顯著下降（P < 0.01），而IFN-γ水平明顯升高（P < 0.05）。但當同時給予Fludarabine處理時，可見Th1/Th2失衡的改善效果不足，甚至血清和BALF中的IFN-γ水平同哮喘模型大鼠比較，差異無統計學意義（P > 0.05），且與哮喘寧組大鼠比較，哮喘寧顆粒+Fludarabine組大鼠的IL-4和IFN-γ水平分別有明顯的上調和下降（P < 0.05），證實Fludarabine阻礙哮喘寧顆粒的治療效果。見表1。

2.2 五組肺組織pSTAT1和STAT1蛋白水平變化

各組大鼠肺組織內的STAT1蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。與正常組比較，哮喘模型組大鼠pSTAT1蛋白水平明顯減少（P < 0.01）；與哮喘組比較，IL-27預防組和哮喘寧顆粒組，pSTAT1水平明顯提高（P < 0.05），且哮喘寧顆粒組治療效果優于IL-27預防組（P < 0.05）；與哮喘寧顆粒組比較，哮喘寧顆粒+Fludarabine組pSTAT1表達水平明顯降低（P < 0.01）。這一結果提示哮喘寧顆粒的治療作用與STAT1通路相關。見圖1。

3 討論

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，以氣道高反應性和可逆性氣流受限為主要特征[6]。其病因繁多，發病機制復雜，而“衛生假說”（Hygiene Hypothesis）是被廣泛認可的哮喘發病原因，基于該假說的免疫學機制，認為Th1/Th2失衡及Th2免疫優勢是促使哮喘發病的重要基礎[7]。目前已有大量的報道[8-9]證實，通過誘導Th1反應，刺激IL-12、IFN-γ生成，抑制Th2相關細胞因子的分泌，使Th1/Th2恢復正常，可以抑制哮喘的發生。Th1和Th2兩種細胞通過分泌多種抗炎或促炎的細胞因子，在體內發揮重要的作用，也通過分泌這些細胞因子，二者得以相互抑制。IFN-γ主要由Th1細胞分泌，既具有促炎作用，也具有免疫負向調節功能[10]。在Th1/Th2平衡中，IFN-γ結合并活化其受體，激活下游JAK-STAT通路，進一步上調T-box transcription factor（T-bet）而促進Th1細胞分化。IL-4主要由Th2細胞分泌，單獨采用IL-4孵育Th0細胞，既可以維持Th2細胞的增殖，也可以抑制Th1細胞分化[11]；IL-4是誘導T細胞炎性反應的早期啟動因素，通過增強黏附類、趨化類蛋白的表達，誘導呼吸道內炎癥細胞的聚集、活化，加重支氣管哮喘急性發作的次數和癥狀[12]。IFN-γ和IL-4在哮喘的發病過程中起著重要作用，并與哮喘的嚴重程度相關[11]。在本研究中，可見哮喘寧顆粒明顯上調血清和BALF中的IFN-γ水平，降低IL-4水平，提示哮喘寧顆粒具有改善Th1/Th2失衡的作用。

本研究結果顯示，IL-27可能在哮喘的病理生理機制中扮演著重要角色[13]。IL-27為新發現的IL-12家族的細胞因子[14]，能夠促進Th1型細胞免疫應答，抑制Th2細胞應答[15]。本研究發現在大鼠哮喘模型中，IL-27預防組血清和BALF中的IL-4水平明顯降低，證實大鼠哮喘模型體內的Th2水平受到抑制。這一結果同Su等[16]的研究結果相似，Su發現IL-27提前給藥可以抑制哮喘小鼠BALF中的IL-5和IL-13水平，推測抑制小鼠哮喘模型體內的Th2水平。同IL-27預防組表現相似的是，哮喘寧顆粒也可以明顯抑制哮喘大鼠體內的IL-4和Th2水平。鑒于比較哮喘寧顆粒同IL-27預防對Th1/Th2平衡的目的，本研究在驗證IL-27預防對Th2水平代表因子IL-4影響的基礎上，還檢測IL-27預防對Th1水平特征性因子IFN-γ的影響，發現哮喘寧顆粒同IL-27預防均可以增強哮喘大鼠體內的IFN-γ和Th1水平。根據以上結果，推測哮喘寧顆粒抑制哮喘發作的機制可能同IL-27調控通路相關。

研究[17-18]發現，IL-27可以誘導Th細胞向Th1方向分化并分泌IFN-γ。Th細胞表面分布的IL-27受體與IL-27結合后，激活STAT1通路，由受體上的pg130亞基招募JAK1或JAK2，JAK發生自身磷酸化后再進一步磷酸化和二聚化STATs分子，而二聚化的pSTATs轉位進入細胞核中，結合于特定的靶基因序列，發揮轉錄因子的作用。Villegas-Mendez等[19]研究發現，IL-27能夠上調小鼠Th細胞轉錄因子T-bet表達水平，進而促進Th1細胞分化和分泌IFN-γ；IL-27和JAK-STATs通路除了可以促進Th1的細胞分化，也可通過上調IL-12Rβ2的表達間接抑制Th2細胞的特異性轉錄因子GATA-3表達，但是，阻斷STAT1磷酸化水平可以減弱IL-27抑制Th2的作用，證明IL-27通過STAT1磷酸化抑制Th2細胞分化[20]。STAT1磷酸化對于IL-27生物學功能的正常發揮極為重要[21]，Chen等[22]發現，血清IL-4水平高的哮喘患者存在IL-27治療耐受的現象，IL-27無法抑制Th2細胞分化，隨后發現這一現象可能與IL-4誘導Th細胞抑制STAT1磷酸化相關。研究[4，24]表明，支氣管哮喘氣道中 STAT1 磷酸化障礙，引起IL-27抑制Th2細胞功能受損，導致Th1/Th2平衡失調，誘發、加重哮喘。因此，提高STAT1磷酸化水平，增強IL-27通路對Th2細胞的抑制作用，恢復哮喘患者氣道內Th1/Th2免疫平衡，給哮喘治療提供了新的通路及靶點。

在本研究中，哮喘寧顆粒可有效改善Th1/Th2平衡，但加入STAT1抑制劑后，這一改善作用失效，提示STAT1磷酸化對哮喘寧顆粒調節Th1/Th2平衡起重要的作用。根據肺組織中STAT1磷酸化水平的比較，進一步證實哮喘寧顆粒同IL-27預防給藥均可以上調pSTAT1水平，增加STAT1通路的磷酸化，但加入STAT1抑制劑Fludarabine后，阻礙了哮喘寧顆粒逆轉pSTAT1水平下調的作用，證實哮喘寧顆粒的治療作用與STAT1通路的磷酸化相關。

根據以上結果，本研究認為哮喘寧顆粒抑制哮喘發作的機制是通過IL-27介導的STAT1通路改善Th1/Th2失衡而實現的。然而，STAT1通路還有哪些信號分子參與，仍需要深入的研究。

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（收稿日期：2018-01-07 本文編輯：封 華）