米諾環素對氟尿嘧啶誘導的小鼠腸黏膜炎的保護作用研究

黃義新 劉煒

[摘要] 目的 研究米諾環素對氟尿嘧啶（5-Fu）誘導的腸黏膜炎的保護作用。 方法 40只雄性Balb/c小鼠，隨機分為5組，正常組、模型組、米諾環素低劑量組及高劑量組，每組10只。模型組由連續腹腔注射5-Fu（80 mg/kg）3 d誘導，治療組同時灌胃給予30 mg/kg或60 mg/kg的米諾環素。測定小鼠體質量、腹瀉指數，同時對小鼠空腸進行HE染色，測定小腸黏膜中的促炎性細胞因子，并對小鼠腸內容物中的短鏈脂肪酸進行測定，進而評價米諾環素對小鼠腸黏膜炎的保護作用。 結果 高劑量米諾環素可顯著增加腸黏膜炎模型小鼠的體重（P < 0.01），降低其腹瀉指數（P < 0.01），增加模型小鼠的空腸絨毛長度（P < 0.01）。此外高劑量米諾環素可顯著抑制腸黏膜中的IL-6（P < 0.05）和TNF-α（P < 0.01）的表達，同時增加小鼠腸內容物中丁酸及乙酸的含量（P < 0.01）。 結論 米諾環素具有確切的腸黏膜保護作用，其作用與其抗炎及促進短鏈脂肪酸的生成有關。

[關鍵詞] 米諾環素；氟尿嘧啶；腸黏膜炎；短鏈脂肪酸

[中圖分類號] R730.53 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（a）-0020-05

Protective effects of Minocycline on 5-Fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice

HUANG Yixin LIU Wei

Department of Pharmacy， Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100038， China

[Abstract] Objective Forty investigate the protective effect of Minocycline on 5-Fu induced intestinal mucostitis. Methods 40 male Balb/c mice were randomly divided into four groups （n = 10）， Control group， 5-Fu induced mucositis model， high dose or low dose of Minocycline treated group. After the mice were intraperitoneal administrated with 80 mg/kg 5-Fu for 3 days and simultaneously treated with 30 or 60 mg/kg orally in Balb/c mice， the body weight loss， diarrhea scores， and HE stain of the intestinal， pro-inflammatory cytokines in intestine tissue and short chain fatty acids in colon contents were also determined. Results Data from this study indicated that high dose minocycline could attenuate the 5-Fu induced body weight loss （P < 0.01）， and lower the diarrhea scores （P < 0.01）. Also minicycline in high dose increased the intestinal vill length （P < 0.01）， decreased the IL-6 （P < 0.05） and TNF-α （P < 0.01）. In the colon contents， Minocycline could significantly increase the SCFAs concentration， especially for aceticacid butyricacid （P < 0.01）. Conclusion All these results demonstrated that Minocycline exert protective effects on 5-Fu induced intestinal damage in mice， and these protective effects may partially oriented from its anti-inflammatory effects and enhancing short chain fatty acid production.

[Key words] Minocycline； 5-Fluorouracil； Intestinal mucositis； Short-chain fatty acid

米諾環素為常見的四環素類抗生素，其抗菌譜廣、抑菌活性強且持久[1]，目前臨床上多用于治療支原體感染、尿道感染、支氣管炎、毛囊炎等[2-3]。因米諾環素具有較好的脂溶性，口服生物利用度較高，可分布于全身各組織，尤其可透過血腦屏障等生理性屏障[4]。近年來，有研究表明米諾環素具有抗炎、抗凋亡等作用，可顯著抑制炎癥、應激、腦出血等誘導的神經損傷[5]。

氟尿嘧啶（5-Fu）為臨床上常用的化療藥物[6]，可用于治療消化系統腫瘤、乳腺癌等[7-8]，但其胃腸道不良反應明顯，可引起化療患者食欲減退、腹瀉、便血等，嚴重限制了其臨床應用[9]。研究表明這些不良反應可能與5-Fu誘導腸黏膜損傷，進而引起炎性反應有關[10-11]。此外，5-Fu還可引起腸道菌群失衡，導致腸內容物中短鏈脂肪酸的減少，而短鏈脂肪酸，如丁酸等具有支撐腸上皮細胞屏障的功能[10，12]。

尋找具有抗炎及保護腸黏膜功能的藥物，進而降低5-Fu的胃腸道不良反應，這對改善化療患者的生活質量和化療效果具有重要意義[8]。本文擬研究米諾環素對5-Fu誘導的小鼠腸黏膜炎的保護作用，以期為相關藥物的開發及拓寬米諾環素的臨床應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 5-Fu、米諾環素、四甲基戊酸購自美國Sigma公司；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸購自德國Ehrenstorfer公司；磷酸及乙酸乙酯（GC-MS級）均由德國Merk公司提供；小鼠TNF-α和IL-6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號分別為B226815， B229138）由美國Biolegend公司提供。實驗用水為超純水，由Milli-Q Gradient A10制備。實驗中其他試劑均為分析純，購自南京化學試劑廠。

1.1.2 實驗動物 SPF級Balb/c小鼠由揚州大學比較醫學實驗中心提供，合格證號為SKXK（蘇）2012-0004，小鼠雌雄各半，8～10周齡，體重18～22 g。動物倫理由首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院倫理委員會批準，符合相關規定。動物飼養于溫度為24～26℃房間中，每天7：00～19：00給予光照，動物自由飲食飲水。小鼠每天早上抓握半分鐘適應1周后，進行后續的動物實驗。

1.1.3 實驗儀器 Thermo 2IR型高速低溫離心機，Olympus顯微鏡（含DP2-BSW計算機圖像分析系統），BS323S 電子天平（Sartorius公司，精確值0.0001 g），酶標儀（Biotek公司），GC6890N型氣相色譜儀，配有 FID 檢測器（美國Agilent公司），渦旋振蕩器（Scientific Industries Inc. USA）。

1.2 方法

1.2.1 藥物的配制 5-Fu用生理鹽水配置成8 mg/mL的溶液（必要時加熱至50℃溶解后，冷卻備用），米諾環素采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液混懸為3 mg/mL和6 mg/kg的混懸液備用。

1.2.2 小鼠腸黏膜炎的誘導及給藥方案 40只SPF級Balb/c小鼠，采用完全隨機分組法將動物隨機分為正常組、模型組、米諾環素低劑量組合米諾環素高劑量組，每組動物各為10只，雌雄各半。正常組小鼠每天腹腔注射生理鹽水10 mL/kg，模型組前3 d每天腹腔注射配制好的5-Fu10 mL/kg（即給藥劑量為80 mg/kg），米諾環素給藥組在造模1 h后，灌胃給予相應劑量的米諾環素藥液進行藥物干預[9]。

于第7天，取各組小鼠的空腸，經生理鹽水沖洗干凈腸內容物后，取約1 cm的空腸置于10%的中性甲醛中，固定；其余的空腸，縱向剖開，平鋪于冰板上，采用載玻片刮下腸黏膜備用；同時收集小鼠盲腸內容物，用于后續的短鏈脂肪酸的測定。

1.2.3 小鼠體重及腹瀉指數 每隔1 d（0、1、3、5、7 d）記錄1次體重；腹瀉情況通過對糞便進行評分[13]，具體如下：0分：糞便正常或未見糞便；1分：輕度腹瀉，糞便有輕微濕軟；2分：中度腹瀉，糞便不成形，且較為濕潤較濕，且伴有輕度的肛周糞便著色；3分：重度腹瀉，水樣便并伴有重度肛周著色。通過比較各組動物的腹瀉指數及體重情況進行藥效評價。

1.2.4 HE染色劑及腸上皮絨毛長度 經中性甲醛固定的空腸，經過常規取材，脫水，石蠟包埋，切片后進行常規的HE染色，并在顯微鏡下觀察小腸病理變化，同時進行評分。主要包括腸黏膜上皮細胞有無變性、壞死，絨毛間質是否水腫；黏膜固有層的炎細胞浸潤情況；黏膜下層、肌層、漿膜層有無充血、水腫、炎細胞浸潤等損傷。根據上述病變的嚴重程度分別記分為0分（無明顯病變）、0.5分（輕微病變）、1分（輕度改變）、2分（中度病變）、3分（較為嚴重），通過累加所有分數，得出總的病變評分[10，13]。

小腸絨毛長度的測定采用在200倍光鏡下利用顯微鏡自帶的圖像分析系統（DP2-BSW）測量，隨機選擇3～5各視野，計算每個視野下所有腸絨毛長度的平均值，進一步計算所有視野中的腸絨毛長度均值，進行后續的統計分析。

1.2.5 小鼠腸黏膜中TNF-α和IL-6的測定 取小鼠空腸的腸黏膜約50 mg，加入9倍體積的冰磷酸緩沖液（PBS，pH=6.8），冰浴下勻漿，12 000 g離心5 min，取上清，按小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒操作步驟進行。同時上清液采用BCA法定蛋白，用于校正腸黏膜中的細胞因子濃度（pg/mg蛋白）。

1.2.6 腸內容物中短鏈脂肪酸測定 精密稱取約0.1 g的腸內容物，加入9倍體積的0.5%的磷酸水溶液，在4℃條件下劇烈渦旋2 min使腸內容物充分分散，12 000 g離心5 min，取上清0.5 mL，加入10 μL內標（200 μg/mL的四甲基戊酸）和0.5 mL乙酸乙酯，4℃渦旋2 min后，15 000 g離心10 min，取乙酸乙酯層，進行GC-FID分析。

GC-FID分析中，色譜柱為PEG-20型彈性石英毛細管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升溫：0～5 min，85～160℃（15℃/min）；5～15 min，150～230℃（8℃/min）；15～18 min，230℃，保持3 min；18～21 min，230～170℃（20℃/min）；檢測器溫度270℃；進樣口溫度220℃；分流進樣，進樣量1.0 μL；載氣為高純氮氣，流速2.1 mL/min。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 13.0對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料用率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體重及腹瀉評分

與正常組小鼠比較，腹腔注射5-Fu后，模型組小鼠給藥后體重顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。而給予30 mg/kg或60 mg/kg的米諾環素后，小鼠體重與模型組相比，顯著增加，其中米諾環素高劑量組效果最佳。見表1。

從腹瀉指數上看，模型組小鼠在造模前2 d未見明顯的腹瀉癥狀，從3 d開始可見輕微的腹瀉，隨著時間的延長，模型組小鼠腹瀉指數顯著增加。而給予30、60 mg/kg米諾環素后，小鼠的腹瀉情況可見明顯改善，其中米諾環素低劑量組在第5天和第7天的腹瀉指數與模型組相比，顯著降低（P < 0.05），而米諾環素高劑量組在第3天開始，其腹瀉指數顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.2 小腸病理及腸上皮絨毛長度統計結果

正常組小鼠空腸結構完整，可見清晰的黏膜層，黏膜下層、肌層和漿膜層絨毛細長且排列規則整齊。而模型組小鼠空腸結構可見上皮細胞出現輕度或者中度的變性，且有部分小鼠空腸出現水腫，從固有層看，有一定的充血，且出現炎癥細胞的浸潤[6]。而給予不同劑量的米諾環素后，上述病理改變可見明顯改善。見圖1。

從病理學評分上看，正常組小鼠未見明顯病理學改變，但5-Fu誘導的腸黏膜炎小鼠的空腸，其病變評分顯著增加。給予30 mg/kg和60 mg/kg的米諾環素后，其病變評分顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），提示米諾環素具有一定的保護5-氟尿嘧啶誘導的腸黏膜損傷的作用。進一步測定其絨毛長度，模型組絨毛長度顯著降低（P < 0.01），而給予不同劑量的米諾環素后，可顯著改善由5-Fu誘導的絨毛損傷（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

2.3 TNF-α和IL-6測定結果

與正常組小鼠腸黏膜中的TNF-α表達情況相比，模型組小鼠血漿中的TNF-α表達顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.01）。IL-6的含量在模型組小鼠腸黏膜中亦顯著增加（P < 0.01）。給予米諾環素后，低、高劑量的米諾環素均對5-Fu誘導的小鼠腸黏膜炎癥損傷有改善作用（P < 0.05或P < 0.01）。見表4。

2.4 盲腸內容物中短鏈脂肪酸含量

與正常組小鼠腸內容物中乙酸、丙酸、丁酸、及戊酸的濃度相比，5-Fu誘導的腸黏膜炎小鼠盲腸內容物中上述四種短鏈脂肪酸含量顯著下降（P < 0.01）。而給予低劑量米諾環素后，小鼠盲腸中的乙酸含量與模型組相比，顯著增加（P < 0.05），其他短鏈脂肪酸均有所增加但差異無統計學意義（P > 0.05）。給予高劑量米諾環素后，小鼠盲腸中的乙酸、丙酸、丁酸的含量則顯著提高，其中乙酸和丁酸含量顯著提高（P < 0.01）。見表5。

3 討論

本實驗通過對小鼠體重、腹瀉評分、空腸病變及絨毛長度、腸黏膜中促炎性細胞因子含量及盲腸內容物中的短鏈脂肪酸，研究米諾環素對5-氟尿嘧啶誘導的腸黏膜炎小鼠保護作用。實驗結果表明米諾環素具有較好的保護作用。

研究表明化療藥物，如5-Fu可通過直接損傷腸上皮細胞，誘導腸上皮細胞凋亡，進而發生炎癥級聯反應，誘導腸黏膜損傷[8]，進而導致腹瀉、嘔吐、便血等系列胃腸道不良反應，嚴重限制了其臨床應用。本研究選擇米諾環素作為研究對象，基于其具有一定的抗菌作用、抑制神經炎癥等文獻報道[2，4]，發現米諾環素可顯著改善5-Fu誘導的小鼠體重減輕及腹瀉癥狀。進一步從病理學及腸絨毛長度發現，米諾環素可顯著改善5-Fu誘導的小腸病變和絨毛萎縮。

由于5-Fu誘導的腸黏膜損傷可能與炎性反應和菌群失調等有關[6，8，10]，本研究進一步的通過ELISA研究米諾環素對腸黏膜中的促炎性細胞因子TNF-α和IL-6表達的影響，結果提示米諾環素可顯著抑制上述促炎性細胞因子的表達，這與米諾環素抑制LPS誘導的小膠質細胞活化等結果類似，進一步佐證了米諾環素的抗炎作用。

此外，由于腸黏膜損傷可能還與腸道菌群紊亂及其繼發的短鏈脂肪酸（SCFAs）生成減少有關[14-16]，SCFAs為食物中膳食纖維經腸道菌群發酵后的降解產物，可為腸上皮細胞提供能量[17]，進而維護腸道上皮細胞的屏障功能，保護小腸杯狀細胞的分泌功能完好[18]，同時還可以促進腸黏膜細胞的增殖[19]。本研究通過檢測盲腸內容物中的SCFAs的濃度，研究結果提示，米諾環素可顯著提供小鼠結腸中的丁酸的含量，而丁酸具有確切的促進腸上皮細胞增殖，保護腸上皮細胞損傷的功效[20]，這從另外一個方面確證了米諾環素對5-Fu誘導的腸黏膜炎的保護作用。

本研究對拓寬米諾環素的臨床應用，尋找較好的改善5-Fu化療的輔助用藥具有重要意義，后續應對米諾環素的保護作用機制進行深入研究。

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（收稿日期：2018-08-31 本文編輯：蘇 暢）