植物合成生物學課程實驗教學初探

潘煒松 汪啟明 譚成方 劉齊軍

摘 要 植物合成生物學是生命科學相關專業重要的前沿專業課程，課程實驗對于學生深刻把握合成生物學的學科理念和實驗技術具有重要的意義。結合教學實踐，本文介紹了我校植物合成生物學課程實驗的設計思路和實踐經驗。

關鍵詞 植物合成生物學 創新人才 人才培養

中圖分類號：G424? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ?DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2019.04.048

Abstract Plant synthetic biology is an important specialized course of life science. The experiment teaching of plant synthetic biology is of great significance for students to grasp the concept and experimental technology of synthetic biology. Combining with teaching practice in our university， this paper introduces the design idea and practical experience of the experiment of plant synthetic biology.

Keywords plant synthetic biology; innovating talent; cultivation

2010年5月21日，美國生物學家及企業家J. Craig Venter領導的合成生物學研究團隊在Science發表了具有劃時代意義的研究成果——首個人造生命（命名為“辛西婭，Synthia 1.0”）。其通過完全化學方法合成的基因組包含約901個基因序列，長達100萬堿基對。[1]在初代辛西婭的基礎上，6年后該團隊繼續在Science雜志報告稱，他們設計并合成出一種具有最小基因組的微生物（“Synthia 3.0”），辛西婭3.0具有473個基因，在實驗室條件下可以自我復制。[2]這些成果是合成生物學領域的里程碑式進展，大大推進了對生命奧秘的認知。合成生物學作為一種方興未艾的具有顛覆性意義的新興技術，已迅速發展為一門新興的交叉學科，其重要的研究意義和巨大的應用前景引起了科學界乃至社會各界廣泛的關注和討論。

2017年科技部《“十三五”生物技術創新專項規劃》指出，合成生物技術為顛覆性技術，要突破人工生命元器件、基因線路和生物計算、人工生命體，構建DNA合成與組裝、生物計算與設計、元件木塊底盤庫共享平臺，以及可生產化學品、材料、天然產物、生物能源的人工細胞工廠，搶占合成生物學戰略制高點。針對合成生物學蓬勃發展的現狀，及其巨大的應用前景和發展潛力，作為生命科學專業的本科生有必要對這一學科進行深入的了解。這門學科盡管建立時間不長，但發展極其迅猛，其理論研究意義和工業應用潛力已逐漸凸顯。目前國內普通高校中面向生命科學相關專業本科生開設這門課程的不是很多，但許多國外一流高校（如MIT、哈佛大學等）以及有些國內985高校已經開始將其作為高年級本科生的專業課程。作為生命科學相關專業的教師，筆者認為將合成生物學作為的一門高級選修課程，面向生物工程、生物科學、生物技術等專業高年級本科生介紹這門新興學科的學科理念、技術體系和應用價值等是極有必要的。鑒于植物學科在農林院校的優勢地位，我們首先向學生介紹植物合成生物學課程。本文就植物合成生物學選修課程的實驗部分的開設作一簡要介紹。

合成生物學創新發展了一系列優秀的實驗技術，從基本功能元件的構建與標準化，到高通量的微芯片基因合成技術與各種尺度（從bp至Mb）的DNA拼接組裝方法，再到強大的基因組編輯工具，底盤細胞也因工具的不斷創新得到了快速發展。微生物最小基因組的分析以及對基因組的連續刪簡優化，為構建一個具有可預測、可控制表型的優良底盤細胞奠定了基礎，為促進基于細胞療法的人類疾病治療，哺乳動物細胞作為底盤細胞也正在開發中。[3]因此，要較好的消化理解這些全新的實驗技術，理解和掌握合成生物學最核心的工程化、標準化理念，光靠紙上談兵顯然是不行的，因此，我們反復討論了植物合成生物學課程實驗的設計方案，對實驗教學內容進行精心設計，力求在較短學時數內完成從轉錄單位的構建，多個轉錄單位的組裝及在模式植物中的表達與檢測的實驗流程。

合成生物學是生物技術在分子生物學和基因工程層面上的自然延伸，可以說，基因工程和合成生物學是生物技術發展的兩個階段，前者是后者的基礎。但二者并沒有明確的界線，有相當一部分內容是重疊的。[4]因此，我們在設計實驗課程時注意到了與分子生物學實驗課程的關系，避免重復性教學。在基因工程的實施過程中一般只轉移個別外源基因，而合成生物學通常是轉移一組基因，涉及到代謝途徑甚至代謝網絡等。合成生物學的核心理念是標準化、系統化、工程化。它遵循標準化-設計-建模/模擬-實施-測試的工程學思想。合成生物學家力圖通過工程化的方法，將復雜的生物系統合理簡化拆分為各個功能元件，通過對生物元件的逐級組裝，直至設計和構建具有嶄新功能的合成生物系統。[5]

傳統的多基因克隆系統往往涉及繁雜的克隆操作，基于IIs型限制性內切酶建立的克隆系統（如Golden Gate 、[6]Moclo、 [7]Golden Braid）[8-9]則具有獨特的優勢。[10]傳統克隆方法所使用的II型限制性內切酶識別和切割回文序列（例如內切酶HindIII識別和切割AAGCTT）。而IIs型限制性內切酶識別的一般為非回文序列，切割反應在識別位點以外進行?；贗Is型內切酶的克隆方法就是在同一反應體系中，利用IIs型限制性內切酶在識別位點之外切開DNA的特性，產生符合設計者要求的粘性末端，最后通過連接酶將多個片段按設計要求“無縫”拼接成不含酶識別位點的DNA。本課程實驗選用了已經在植物合成生物學領域得到了廣泛采用的西班牙植物分子與細胞生物學研究所（IBMCP）Diego Orzaez教授實驗室所建立的GoldenBraid系統。GoldenBraid系統是一種模塊化的組裝系統，對于啟動子、編碼序列、終止子等組件（GBparts）賦予不同的首尾部標記，通過兩種IIs型限制性內切酶（BsaI和BtgzI）的交叉使用，GoldenBraid系統可以實現轉錄單位在兩類載體中（LEVEL%Z和LEVEL%R載體）的來回組裝以致無窮（類似于“編織”，固命名“Braid”），而僅僅取決于載體的容量。另一方面，由于有多種預制組件（如啟動子，終止子，報告基因等）可以使用，大大減少了多基因組裝所需的工作量。同時Diego Orzaez教授實驗室也開發了網頁工具可以在線輔助GoldenBraid組裝（https：//gbcloning.upv.es/）。

因為熒光蛋白轉化植物后，易于觀察。本課程實驗選用熒光蛋白基因（DsRed和GFP）作為操作對象，從內化、多部分組裝、雙向組裝到轉化植物，整個課程實驗包括4個單元，共24學時。

（1）內化實驗（domostication）：將DNA構件（稱為GBpart或GBSpart）連入GoldenBraid2.0語法的過程稱為內化。內化過程通常包括使用GB引物做PCR擴增目的DNA（詞或者詞組）以及將PCR產物通過BsmBI限制-連接反應連入pUPD2載體。如果目的DNA內部含有BsaI、BsmBI及BtgZI識別位點，還應通過PCR反應來去除上述酶切位點。我們內化的是DsRed基因和GFP基因。

（2）multipartite assembly：多部件組裝，將DNA構件（熒光蛋白基因）連入pUPD2后，還需將其與啟動子及終止子組成轉錄單位（transcription unit， TU）。選擇符合語法（前后綴匹配）的GB parts，通過BsaI或BtgZI/BsmBI酶切-連接，可將各個構件分別連入目標載體（destination vector， pDGB）pDGB alpha或pDGB omega，組裝為pDGB1alpha1-35s_GFP_Tnos（TU1）和pDGB1alpha2-35s_DsRed_Tnos（TU2）。

（3）二元組裝：本課程實驗是要在煙草中同時表達紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白，因此還需要將第2個實驗單元組裝的轉錄單位進一步組裝在一起。如果要組裝多個轉錄單位，可以通過兩兩組裝的方式來進行。通過BsaI酶切-連接，可將上述兩個轉錄單位組裝入pDGB1omega1載體，構建為pDGB1omega1_TU1：TU2。如果需繼續組裝第3個轉錄單位，須將TU3連入pDGB1omega2 （pDGB1 omega 2_TU3）。通過BsmBI酶切-連接，在一個試管內加入pDGB1omega1_TU1：TU2、pDGB1omega2_TU3及pDGB1alpha1，則組裝為pDGB1alpha1_TU1：TU2：TU3，以此類推可一直組裝下去。

（4）轉化植物：由于pDGB1是基于pGreenII骨架構建的，所以pDGB1omega1_TU1：TU2可以直接轉化農桿菌（c58（pSoup）），然后通過農桿菌介導的方式，采用注射法轉化本生煙草（Nicotiana benthamiana）葉片。需在實驗前提前一個月左右安排學生播種煙草，以便到時有煙草可以使用。一般轉化1周后，可以觀察到紅色熒光蛋白的表達，通過手持式紫外燈還可以觀察到GFP的表達。

21世紀是生命科學的時代，而生命科學轉化為實用技術最有前途的橋梁之一就是合成生物學。我國正處于建設創新型國家的關鍵時期，合成生物學等高技術產業的發展在國民經濟的發展中毫無疑問將起到重要的作用。我國在合成生物學領域的起步比西方發達國家晚，但近年進步極快。很多高校都開設了合成生物學相關的課程，相信隨著我國在合成生物學領域人才培養體系的不斷完善，越來越多的優秀科技創新人才會走上崗位，極大推動我國的合成生物學產業的發展。本文對我校建設植物合成生物學課程實驗的探索做了介紹，學生們普遍反響收獲很大。合成生物學實驗教學體系應堅持以培養學生創新能力為出發點，通過嚴謹科學的態度和扎實細致的工作，最終形成卓有成效的合成生物學領域創新人才培養模式，為建設創新型國家培養大批科技創新人才。

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