助陽補肺除痹顆粒對肺纖維化大鼠肺組織超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量影響的研究*

胡少丹，仕 麗，孫 峰，劉守華，楊 波，匡 旭，李菁婧

長春中醫藥大學附屬醫院肺病科(長春 130021)

間質性肺疾病(Interstitial lung disease,ILD)為呼吸系統疑難病，其致殘率、死亡率高、發病率呈上升趨勢，肺纖維化作為多種肺部疾病的最終病理結局，西醫治療的局限性和實施難度日漸突出，其中肺纖維化尚無有效治療藥物，激素等治療毒副反應大。鑒于目前國內、外尚無有效治療ILD的藥物，結合其不斷擴大的市場需求，我課題組研制助陽補肺除痹顆粒，針對該病慢性期的治療，從脾腎陽虛出發，以補腎、溫陽、通絡為創新點，用于ILD的脾腎陽虛證治療。具有一定應用前景及應用價值，體現出了中醫藥治療的優勢，獲得了良好的經濟效益和社會效益，臨床應用療效顯著，本次從實驗方面探討該藥治療肺纖維化的相關問題。肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)一般指在毒物、自發免疫反應、藥物副反應、感染、嚴重外傷等不同因素刺激下引起的肺部炎癥反應，以肺泡表面上皮細胞損傷，炎性細胞累積，成纖維細胞增生，細胞外基質沉積和疤痕形成為主要特征，最終導致正常肺組織結構改變、功能喪失的一類疾病，是間質性肺疾病的終末結局。博來霉素是鏈霉菌屬中抗生素株中提取的糖膚類物質。臨床上，博來霉素常用于治療淋巴瘤、睪丸癌、鱗狀細胞癌等。使用博來霉素早期可出現全身炎癥反應及類似肺炎癥狀，而后期則繼發嚴重的肺纖維化。由于其導致動物肺間質纖維化模型與人類肺間質纖維化病理過程相似，所以常被用來制作肺纖維化的動物模型。本實驗研究以醋酸潑尼松為陽性對照組，用助陽補肺顆粒進行治療，觀察助陽補肺顆粒對大鼠肺組織中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的影響。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：SPF級Wistar大鼠，180只，體重200～220 g，雌、雄各半。購自遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2 藥品與試劑：助陽補肺除痹顆粒(規格：10 g/袋，人用量：10 g/次、3次/d，生產批號：20130301、20170201)，由長春中醫藥大學附屬醫院制劑中心提供；醋酸潑尼松片(規格：5 mg/片×100片/瓶，國藥準字H12020689，產品批號：131204，天津天藥藥業股份有限公司)；氯化鈉注射液(國藥準字H23020501，產品批號：B14081711-2，黑龍江科倫制藥有限公司)；注射用鹽酸博來霉素(1.5萬USP/支/盒，國藥準字H20055883，海正輝瑞制藥有限公司)。基質金屬蛋白酶(Materix metallo ptoteinase,MMP) ELISA檢測試劑盒(產品批號：20170901A，美國R&D公司)；SOD用ELISA檢測試劑盒(批號：20170901A，美國R&D公司)，MDA用ELISA檢測試劑盒(產品批號：20170901A，美國R&D公司)，羥脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)ELISA檢測試劑盒(產品批號：20170901A，美國R&D公司)。

2 研究方法

2.1 動物分組：SPF級Wistar大鼠，按體重隨機分為6組，每組30只。分別為假手術組、模型組、醋酸潑尼松組，及助陽補肺除痹顆粒高劑量、中劑量和低劑量組。

2.2 模型制備：實驗動物購入后常規飼養，適應環境7 d。實驗時以10%水合三氯乙醛3 ml/kg腹腔注射將動物麻醉，使其仰臥固定于鼠板，頸部剪毛。常規消毒皮膚，無菌操作下做長約0.5～1cm的頸中切口。逐層剝離暴露氣管，然后抬高鼠板頭端，使其與實驗臺面成30～35°角。在直視下用1 ml注射器刺入氣管，盡量接近氣管分叉處，保持針頭與氣道方向一致，快速推注注射用鹽酸博來霉素(BLEOCIN)加生理鹽水溶液0.2 ml(BLEOCIN每支15 mg，使用前以生理鹽水配制成濃度為5 mg/ml，按5 mg/kg體重給藥)后，立即拔出針頭，豎立鼠板，保持大鼠直立體位，左右來回旋轉3 min，使藥液盡可能到達兩側肺部，分布均勻。縫合皮膚，連續3 d腹腔注射青霉素溶液,防止傷口感染，待動物自然蘇醒后置籠內常規飼養。其中，假手術組大鼠手術操作方法與其它各組相同，只是手術后氣管內注入等量生理鹽水代替鹽酸博來霉素。

2.3 給藥:各組大鼠自氣管內注入鹽酸博來霉素建模后第2日起每天灌胃給藥1次。醋酸潑尼松組予醋酸潑尼松5 mg/(kg·d)，助陽補肺除痹顆粒高、中、低組分別給予9.28g/(kg·d)、4.64g/(kg·d)、2.32 g/(kg·d)助陽補肺除痹顆粒，連續用藥28 d。

2.4 標本采集：分別于造模后第7天、第14天和第28天給藥后1 h，每組隨機選取10只動物，處死后剖取右側肺組織，按每克肺組織加9 ml生理鹽水，制成10%組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清。

2.5 檢測指標方法：采用分光光度法檢測肺組織SOD活力、MDA含量。

結 果

1 助陽補肺除痹顆粒對肺纖維化動物模型肺組織SOD活性的影響 模型組三批動物肺組織中SOD活性在造模后明顯低于假手術組(P<0.05)，醋酸潑尼松組動物及助陽補肺除痹顆粒高劑量組三批動物肺組織中SOD活性明顯高于同期模型組(P<0.05)，助陽補肺除痹顆粒中劑量組、低劑量組動物肺組織中SOD活性第28天時顯著高于同期模型組(P<0.05)。見表1。

表1 助陽補肺除痹顆粒對肺纖維化動物模型肺組織SOD活性的影響

2 助陽補肺除痹顆粒對肺纖維化動物模型肺組織MDA含量的影響 模型組三批動物肺組織中MDA含量則明顯高于假手術組(P<0.01)，醋酸潑尼松組動物及助陽補肺除痹顆粒高劑量組三批動物肺組織中MDA含量明顯低于同期模型組(P<0.05)，助陽補肺除痹顆粒中劑量組肺組織中MDA含量明顯低于同期模型組(P<0.05)，低劑量組動物肺組織中MDA含量第28天時明顯低于同期模型組(P<0.05)。見表2。

表2 助陽補肺除痹顆粒對肺纖維化動物模型肺組織MDA含量的影響

3 各組SOD、MDAB情況 本實驗結果表明，模型組三批動物肺組織中SOD活性在造模后明顯低于假手術組，肺組織中MDA含量則明顯高于假手術組。SOD活性隨造模時間延長而降低，MDA含量隨造模時間延長增加。說明模型動物肺組織中抗自由基的保護系統功能有所降低，間接促進肺纖維化的形成。陽性對照(醋酸潑尼松)組動物及助陽補肺除痹顆粒高劑量(9.28 g/kg)組三批動物肺組織中SOD活性與同期模型組比較均明顯增高；而肺組織中MDA含量與同期模型組比較均明顯下降。助陽補肺除痹顆粒中劑量(4.64 g/kg)組、低劑量(2.32 g/kg)組動物肺組織中SOD活性于第28天時與同期模型組比較顯著增高。助陽補肺除痹顆粒中劑量(4.64 g/kg)組肺組織中MDA含量與同期模型組比較均明顯下降，低劑量(2.32 g/kg)組動物肺組織中MDA含量于第28天時與同期模型組比較明顯降低。SOD是肺組織的主要抗氧化劑，它分布于細胞表面及胞外基質中，對于保護肺泡細胞及抑制基質的過度重建有重要作用。MDA含量和SOD活力在纖維化階段有所變化，說明助陽補肺除痹顆粒在成纖維細胞過度增殖并分泌大量膠原的過程中，通過增加肺組織中SOD活性，降低MDA的釋放，使肺纖維化進程得到抑制。

討 論

肺纖維化是一類特殊類型的慢性進展性纖維化間質性肺疾病，肺部成纖維細胞過度增殖導致肺部纖維化和結構改變[1]。肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變，也就是正常的肺泡組織被損壞后經過異常修復導致結構異常即疤痕形成。絕大部分肺纖維化病人病因不明，而該病嚴重影響人體呼吸功能，輕度肺纖維化時，呼吸困難常在劇烈活動時出現，因此常常被忽視或誤診為其他疾病。當肺纖維化進展時，在靜息時也發生呼吸困難，嚴重的肺纖維化患者可出現進行性呼吸困難，其他癥狀有干咳、乏力，部分患者有杵狀指和發紺。肺組織纖維化的嚴重后果，導致正常肺組織結構改變，功能喪失，當大量沒有氣體交換功能的纖維化組織代替肺泡，導致氧不能進入血液。患者呼吸不暢，缺氧、酸中毒、喪失勞動力，嚴重者最后可致死亡。特發性肺纖維化發病率和死亡率逐年增加，診斷后的平均生存期僅2.8年，死亡率高于大多數腫瘤，被稱為一種類腫瘤疾病。發病機制至今尚未完全明確，一般認為是多種因素共同作用的結果[2-3]。其中，活性氧如超氧陰離子及過氧化氫是多種疾病的重要介質，包括肺纖維化。在正常的生理條件下，自由基引發的組織損傷可被內源性抗氧化物質所抑制。然而，當這些抗氧化物不足以對抗大量的氧化物即氧化-抗氧化系統失衡時，組織就會發生不可逆性損傷。博來霉素與鐵離子反應可以產生ROS從而損傷蛋白、脂質和DNA，其誘導的肺纖維化包括兩個階段。早期的炎癥階段，大量的炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞浸潤到間質或肺泡中。在隨后發生的纖維化階段，炎癥細胞轉移到肺部后，因被激活釋放過量的氧自由基，除直接引起肺組織的脂質過氧化，啟動炎癥反應,間接促進纖維化的形成。同時,肺纖維化的動物模型或患者中抗自由基的保護系統功能也有所降低。因此，抑制自由基的產生，清除已產生的自由基及加強抗自由基系統，可以拮抗肺纖維化的進程。早期診斷和治療對預后有重要意義，而一些有代表性的生物學標志物可用于早期診斷、判斷預后及療效評價[4-5]。

中醫學通常將肺纖維化納入“喘證”“肺痹”的論治范疇，“肺痹”之名始載于《黃帝內經》，屬中醫“五臟痹”之一[6]。外感邪氣侵襲肌表，邪氣入里，內干于肺，則發為肺痹[7]。臨床表現多為咳嗽、咳痰、喘促、氣短、胸悶、乏力、動則尤甚，或見惡寒肢冷、身體疼痛、四肢腫脹、舌質淡、苔白滑、脈沉細無力[8-10]。其病因病機多為風寒濕邪侵襲，痹阻肢體經絡，日久正氣虧耗、腎氣虧虛，或素體陽虛，肺中虛冷，濕濁內生，痹阻肺絡，經絡不通則為痹矣，治療上以溫腎助陽、補肺通痹為主[11]。助陽補肺除痹顆粒是長春中醫藥大學附屬醫院院內制劑，是我課題組王檀教授根據肺痹病因病機，結合多年臨證經驗自擬而成，由熟地黃、鹿茸、肉桂、炙麻黃、炮姜、人參、炙甘草、桃仁、紅花、豨薟草等藥物組成，有滋陰補血，益腎填精，散寒除濕，通絡散結之功效[12-15]。研究發現，該制劑對于肺纖維化的防治和延緩病情進展有顯著作用，通過抑制自由基的產生，清除已產生的自由基及加強抗自由基系統，有效的拮抗肺纖維化的進程，為肺纖維化的治療開辟新的治療思路。