TLRs在口腔癌細胞中的表達及臨床意義

王雪麗　劉俊輝

【摘要】 目的：探究TLRs在口腔癌細胞中的表達及與臨床的關(guān)系。方法：收集筆者所在醫(yī)院口腔科2014年10月-2015年10月因口腔癌行手術(shù)治療的患者32例為口腔癌組，總結(jié)口腔癌患者性別、年齡、腫瘤大小、分級等信息，并對患者進行術(shù)后隨訪。納入同期入院的正常口腔黏膜患者32例為對照組。采用qRT-PCR檢測腫瘤組織中TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8的mRNA水平的表達，并與腫瘤大小、預(yù)后行相關(guān)性分析。結(jié)果：口腔癌組TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8的mRNA水平的表達均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。口腔癌組織中TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8的mRNA水平的表達與口腔癌腫瘤大小呈正相關(guān)，與生存時間呈負相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。口腔癌組織中TLR1、TLR3、TLR7的mRNA水平的表達與口腔癌腫瘤大小、生存時間無明顯相關(guān)性（P>0.05）。

結(jié)論：TLR1-8亞型在口腔癌患者中的表達異常升高，且TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8的表達與腫瘤大小呈正相關(guān)，與患者生存期呈負相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 口腔癌; Toll樣受體; 表達; 相關(guān)性

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.14.028 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）14-00-03

The Expression and Clinical Significance of TLRs in Oral Cancer Cells/WANG Xueli，LIU Junhui.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（14）：64-66

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of TLRs in oral cancer cells and its relationship with clinic.Method：32 patients with oral cancer who underwent surgical treatment in author's hospital from October 2014 to October 2015 were collected，and as the oral cancer group.The information of sex，age，tumor size and grade of oral cancer patients were summarized，and the patients were followed up.32 patients with normal oral mucosa admitted to the hospital during the same period as the control group.The expression of TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7 and TLR8 in tumor tissues were detected by qRT-PCR.The correlation analysis was performed between the expression of TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7 and TLR8 and the tumors size and prognosis.Result：The mRNA levels of TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7 and TLR8 in the oral cancer group were significantly higher than those in the control group（P<0.05）.The expression of TLR2，TLR4，TLR5，TLR6 and TLR8 in oral cancer tissues was positively correlated with the size of oral cancer and negatively correlated with the survival time，the differences were statistically significant（P<0.05）.The expression of TLR1，TLR3 and TLR7 in oral cancer tissues had no significant correlation with the size and survival time of oral cancer（P>0.05）.Conclusion：The expression of TLR1-8 subtypes is abnormally high in patients with oral cancer，and the expressions of TLR2，TLR4，TLR5，TLR6 and TLR8 are positively correlated with the size of tumors and negatively correlated with the survival time of patients.

【Key words】 Oral cancer; TLRs; Expression; Correlation

First-authors address：Hubei Province Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine，Wuhan 430015，China

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，病理分級多屬中、高分化癌，區(qū)域性淋巴轉(zhuǎn)移率高，而全身遠位轉(zhuǎn)移率較低，對放、化療敏感性差[1]。原發(fā)灶的失控是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，各期平均5年生存率在50%～60%，故探討有效的治療方法是臨床面臨的重大課題[2]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類Ⅰ型跨細胞膜受體[3]。TLRs與多種內(nèi)源性分子結(jié)合后可啟動核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）途徑，NF-κB在腫瘤發(fā)病和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠控制黏附分子、細胞因子和生長因子等一些基因的表達，激活免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)，釋放大量的細胞因子及炎性反應(yīng)趨化因子，形成適合腫瘤生長的微環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。因此，探究TLRs在口腔癌細胞中的表達及與臨床的關(guān)系具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集筆者所在醫(yī)院口腔科2014年10月-2015年10月因口腔癌行手術(shù)治療的病例32例。納入標準：（1）術(shù)前資料、術(shù)中及術(shù)后病理診斷均確診為口腔癌;（2）術(shù)前未行放化療;（3）不合并其他口腔疾病;（4）無其他系統(tǒng)腫瘤病史或放化療病史。口腔癌組患者平均年齡（32.6±12.3）歲;男23例，女9例;腫瘤

0.4～4.7 cm，平均（1.5±2.4）cm;分級：1級11例，2級11例，3級10例;術(shù)后3年內(nèi)腫瘤相關(guān)死亡18例，術(shù)后3年內(nèi)非腫瘤相關(guān)死亡2例。納入同期入院的正常口腔黏膜患者32例為對照組，平均年齡（32.9±14.8）歲;男22例，女10例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究獲得患者及家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

（1）總結(jié)口腔癌患者性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期等信息，并對患者進行術(shù)后隨訪，隨訪至2018年10月31日。（2）獲得樣本。嚴格按照RNAgent Isolation System說明書，抽提總RNA。取1 μg總RNA，嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)在PE公司GeneAmp8 5700型PCR擴增儀上進行，嚴格按照SYBR green說明書加樣，總反應(yīng)體系20 μl，各樣本加cDNA 2 μl;SYBR green 10 μl;商品化引物2 μl[TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8（上海生工）;GAPDH（MQP027158，Genecopoeia公司）];RANase Rree去離子水2 μl。按兩步法反應(yīng)94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，反復(fù)40個循環(huán)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗;兩組均滿足正態(tài)分布的定量資料采用Pearson相關(guān)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TLRs在mRNA水平的表達比較

口腔癌組TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8的mRNA水平的表達均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 TLRs表達與口腔癌腫瘤大小相關(guān)性分析

口腔癌組織中TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8的mRNA水平的表達與口腔腫癌瘤大小呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。口腔癌組織中TLR1、TLR3、TLR7在mRNA水平的表達與口腔癌腫瘤大小無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 TLRs表達與生存時間相關(guān)性分析

口腔癌組織中TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8在mRNA水平的表達與生存時間呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。口腔癌組織中TLR1、TLR3、TLR7在mRNA水平的表達與生存時間無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

3 討論

TLRs是近年來發(fā)現(xiàn)的Ⅰ類跨膜信號傳遞受體，在先天免疫中通過識別病原體相關(guān)分子模式，調(diào)節(jié)吞噬細胞特異性識別抗原，誘導(dǎo)炎癥因子和細胞因子的合成中發(fā)揮重要作用[6]。自1997年Medzhitov發(fā)現(xiàn)第一個與果蠅同源的人Toll樣受體蛋白以來，至今在人類和鼠類中分別發(fā)現(xiàn)10和13種類型[7]。在結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中的研究均表明，TLRs的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。但是TLRs在口腔癌中的作用鮮有文獻報道。通過此次的研究表明，TLRs家族中的TLR1-8亞型在口腔癌中的表達均明顯升高，且顯著高于健康人群。

Virchow等于100多年前就提出了腫瘤起源于慢性炎癥反應(yīng)的假說。目前研究表明，TLRs家族可以通過持續(xù)激活NF-κB信號途徑，導(dǎo)致慢性炎性反應(yīng)持續(xù)存在，進而發(fā)展為惡性腫瘤[9]。TLRs通過與相應(yīng)配體結(jié)合，啟動下游的Myd88依賴/Myd88非依賴兩條信號途徑，進一步激活下游的SPNK/JNK、p38MAPK、ERK1/2信號通路，從而激活轉(zhuǎn)錄因子激活子蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、NF-κB等，啟動炎癥因子及炎癥趨化因子的轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細胞合成釋放TNFα、IL-6、IL-8等炎癥因子與炎癥趨化因子，促成腫瘤微環(huán)境[10]。同時，腫瘤細胞釋放的大量細胞因子可作用于免疫細胞，抑制免疫細胞發(fā)揮作用，進而產(chǎn)生免疫逃逸[11]。因此，在非小細胞肺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌中的研究均表明，TLRs的表達與腫瘤大小、患者預(yù)后密切相關(guān)[12-13]。本研究亦證實，TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8的表達與患者生存時間呈負相關(guān)，TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8表達越高，患者生存期越短，這亦與既往的研究符合。但是，此次的研究發(fā)現(xiàn)TLR1、TLR3、TLR7的表達與生存時間無明顯相關(guān)性，這仍有待進一步探討。

綜上，本研究表明TLR1-8亞型在口腔癌中的表達異常升高，且TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR8的表達與腫瘤大小呈正相關(guān)，與患者生存期呈負相關(guān)。

參考文獻

[1]龍小佳.HPV16E6、p53和TLR1在口腔癌中的表達研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2016.

[2] Salaun B，Coste I，Rissoan M C，et al.TLR3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells.[J].Journal of Immunology，2006，176（8）：4894-4901.

[3]王海欣，吳景華，陳繼科，等.Toll樣受體2對口腔癌Tca8113細胞增殖及凋亡的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，46（2）：152-154.

[4]張陳平.口腔癌的多學(xué)科協(xié)作診治模式[J].中國腫瘤臨床，2015，42（16）：787-790.

[5] Stevens V L，Hsing A W，Talbot J T，et al.Genetic variation in the toll-like receptor gene cluster（TLR10-TLR1-TLR6） and prostate cancer risk[J].International Journal of Cancer，2010，123（11）：2644-2650.

[6]夏寧，鄧健.核轉(zhuǎn)錄因子和細胞間黏附分子在口腔癌細胞中的表達及臨床意義[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10（10）：136.

[7]張志愿.口腔癌的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究現(xiàn)狀與思考[J].中國腫瘤臨床，2015，42（16）：783-786.

[8]張煦，許恩馨，阮敏.Toll樣受體9與頭頸部鱗狀細胞癌關(guān)系的研究進展[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2017，44（5）：596-601.

[9] Mandal R K，George G P，Mittal R D.Association of Toll-like receptor（TLR） 2，3 and 9 genes polymorphism with prostate cancer risk in North Indian population[J].Molecular Biology Reports，2012，39（7）：7263-7269.

[10]許聰，喬亞麗，張道來.Toll樣受體家族成員在人肝細胞癌中的表達及其與炎性體因子的相關(guān)性[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2017，33（9）：1182-1186.

[11]馬英杰.肝硬化患者小腸細菌過度生長與外周血內(nèi)毒素水平、TLR2、TLR4表達的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2018，47（4）：130-133.

[12] Klimosch S N，F(xiàn)?rsti A，Eckert J，et al.Functional TLR5 Genetic Variants Affect Human Colorectal Cancer Survival[J].Cancer Research，2013，73（24）：7232-7242.

[13]宋軍民，楊超，李震，等.結(jié)腸癌臨床病理特征與Toll樣受體4表達的關(guān)系[J].中華實驗外科雜志，2015，32（7）：1686-1688.

（收稿日期：2018-12-14）