MAPK信號通路調(diào)節(jié)卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放

許良濤，李 翔，王蕙婷，劉克建，謝復(fù)煒，劉惠民，謝劍平

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

炎癥，是組織和器官暴露于有害刺激物，如微生物病原體、化合物或有毒的細(xì)胞成分等而產(chǎn)生的一種復(fù)雜防御性反應(yīng)［8］，參與卷煙煙氣誘導(dǎo)的多種相關(guān)疾病，例如吸煙誘導(dǎo)的長期不可控的炎癥反應(yīng)會引發(fā)肺組織損傷，最終導(dǎo)致COPD等慢性疾病的發(fā)生［9］。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinase,MAPK）信號通路包括c-Jun氨基末端激酶1/2（c-Jun N-terminal kinase,JNK1/2）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signalregulated kinase,ERK）和p38［10］。有研究結(jié)果表明，MAPK信號通路與炎癥相關(guān)。Shen等［11］研究發(fā)現(xiàn)，特異性抑制JNK1/2可降低AP-1的轉(zhuǎn)錄活性和活性氧的釋放水平，并通過下調(diào)腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和 白介素 -6（Interleukin-6,IL-6）來抑制百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷和細(xì)胞凋亡。He等［12］研究報道，PM2.5會明顯地激活磷酸化的核因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）、p38和ERK信號通路，同時增加促炎癥因子的基因和蛋白表達(dá)，最終通過炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致慢性阻塞性肺病的發(fā)生。然而卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)信號通路等機(jī)制研究較少，有研究表明，卷煙煙氣中的自由基不僅會激活ERK信號通路［13］，而且可以通過調(diào)節(jié)肺部眾多的氧化還原敏感信號系統(tǒng)誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生［14］。由此提出假設(shè)，卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能通過MAPK信號通路介導(dǎo)。呼吸系統(tǒng)是卷煙煙氣接觸的主要靶器官。本研究中，采用人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）作為受試對象評價卷煙煙氣的體外毒性效應(yīng)，分別使用抑制劑SCH772984、SP600125和SB203580對ERK1/2、JNK1/2和p38進(jìn)行特異性抑制，初步探討煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子釋放與MAPK信號通路的關(guān)系，旨在為卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)疾病的機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

3R4F參比卷煙（美國肯塔基大學(xué)）；BEAS-2B細(xì)胞（美國ATCC細(xì)胞庫）。

二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide,DMSO，美國Amresco公司）；磷酸化ERK1/2抑制劑SCH772984（S7101）、磷 酸 化 JNK1/2抑 制 劑 SP600125（S1460）、磷酸化p38抑制劑SB203580（S1076）（美國Selleck公司）；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（26617，美國Thermo Scientific公司）；兔抗一抗，包括ERK1/2（4695）、磷酸化 ERK1/2（4370）、JNK1/2（9258）、磷酸 化 JNK1/2（4668）、p38（8690）、磷 酸 化 p38（4511）、β-Actin（8457）（ 美國 Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（Enhanced chemiluminescence，ECL）檢測試劑盒（中國碧云天公司）；哺乳動物蛋白質(zhì)提取試劑（78501，美國Thermo公司）；Cell Counting Kit-8試劑盒（CCK-8，日本 Dojindo實(shí)驗(yàn)室）；人 IL-6 ELISA試劑盒（S6050）、人IL-8 ELISA試劑盒（S8000C）、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（SLB50）（美國R＆D system公司）；人支氣管上皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Bronchialepithelialcellbasalmedium，BEBM）+SingleQuots細(xì) 胞 因 子（CC-3171，Clonetics）（美國Lonza公司）。

SW-CJ-2FD超凈工作臺（江蘇省蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國Merck Millipore公司）；60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（430166）、96孔板（3599）（美國Corning公司）；AL204-IC電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；TH4-200顯微鏡（日本Olympus公司）；HERA cell 240細(xì)胞恒溫恒濕培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Spectra MAX 190酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；RM20H轉(zhuǎn)盤吸煙機(jī)（德國Borgwaldt KC公司）；Mini TransBlot Electrophoreti蛋白免疫印跡轉(zhuǎn)印槽（美國BioRad公司）；3-18 K高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；FluorChem E超靈敏自動成像分析系統(tǒng)（美國Protein Simple公司）；Nanodrop 2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 TPM染毒液的配制

3R4F參比卷煙放置于（22±1）℃、相對濕度（60±2）%的環(huán)境中平衡48 h。采用轉(zhuǎn)盤吸煙機(jī)在ISO標(biāo)準(zhǔn)抽吸模式［15］下抽吸20支參比卷煙；用劍橋?yàn)V片（ 92 mm）捕集卷煙主流煙氣總粒相物（TPM），加入適量DMSO萃取劍橋?yàn)V片，超聲振蕩10 min，制備10 mg/mL的TPM儲備液，-80℃保存。除細(xì)胞毒性測試空白對照組培養(yǎng)基中的DMSO濃度為0.5%，其余實(shí)驗(yàn)空白對照組培養(yǎng)基中的DMSO濃度均為0.1%（細(xì)胞毒性測試中，最高TPM染毒劑量為50 μg/mL，其余實(shí)驗(yàn)TPM最高染毒劑量為10 μg/mL）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性測試

使用BEBM細(xì)胞培養(yǎng)液（加SingleQuots細(xì)胞因子）對BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，接種數(shù)目為3×105/皿。在37℃、5%CO2無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的BEAS-2B細(xì)胞接種于96孔板，每孔加200 μL培養(yǎng)基，細(xì)胞接種數(shù)目設(shè)定為1.5×104/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）清洗3次，吸凈PBS溶液。加入200 μL含有不同TPM濃度的培養(yǎng)基，染毒培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，并于37℃下孵育4 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度。

(1)巖棉復(fù)合型保溫模板的組成材料為巖棉保溫板、冷拔低碳鋼絲、聚合物保溫砂漿，該模板具有免拆模、使用安全、耐火等級高、施工便捷等優(yōu)點(diǎn)。

1.2.3 TPM染毒和抑制劑處理

細(xì)胞傳代后培養(yǎng)24 h，細(xì)胞生長達(dá)到80%匯合，進(jìn)行TPM染毒24 h，染毒前1 h對細(xì)胞進(jìn)行抑制劑處理，使用4 nmol/L SCH772984抑制磷酸化的 ERK1/2，使用 50 μmol/L SP600125 抑制磷酸化的 JNK1/2，使用 10 μmol/L SB203580 抑制磷酸化的p38。

1.2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)

Western blot（WB）實(shí)驗(yàn)的簡要流程如下：使用1.2.2節(jié)方法對細(xì)胞進(jìn)行染毒，收獲細(xì)胞于冰上裂解得到細(xì)胞全蛋白，使用分光光度計測定全蛋白濃度，電泳上樣量為20 μg蛋白。制備5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的濃縮膠和8%～15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離膠對蛋白進(jìn)行分離。使用轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上（轉(zhuǎn)膜電壓100 V、轉(zhuǎn)膜時間1 h）。PVDF膜于5%的脫脂奶粉中室溫封閉1 h，使用含0.05%Tween 20的Tris緩沖溶液（Trisbuffered saline and Tween 20，TBST）洗膜3次，每次5 min。使用相對應(yīng)的兔抗一抗于4℃下孵育過夜。次日使用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。使用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗于室溫中孵育1 h。使用TBST洗膜3次，每次5 min。然后使用化學(xué)發(fā)光法ECL試劑進(jìn)行顯影，使用顯影儀拍照。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme lined immunosorbent assay，ELISA）

細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8的釋放水平采用對應(yīng)的人抗體半定量ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表征。使用SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)的組間差異進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)間的最小顯著差異（Least significant difference，LSD）通過單因素方 差 分 析 法（One-way analysis of variance，ANOVA）檢驗(yàn)。p＜0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 卷煙煙氣對細(xì)胞存活的影響

BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)過不同濃度TPM染毒24 h后的存活率（表1）顯示，TPM抑制BEAS-2B細(xì)胞存活率具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)TPM濃度大于10 μg/mL時，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率相較于對照組有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。當(dāng)TPM濃度為10 μg/mL時，細(xì)胞存活率為（90.0±2.0）%，結(jié)合光鏡下BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)（圖1a、圖1b），該濃度染毒24 h不會對細(xì)胞造成明顯損傷。因此，后續(xù)的染毒條件均選擇10 μg/mL染毒24 h。

表1TPM染毒對BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響（n=3）Tab.1 Effect of exposure to TPM on viability of BEAS-2B cells（n=3）

圖1TPM染毒對BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of exposure to TPM on morphology of BEAS-2B cells

2.2 MAPK信號通路參與卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子釋放

MAPK 信號通路包括 ERKs，JNKs和 p38［16］，其在免疫反應(yīng)中具有重要的作用［14］，因此本研究選中取ERK1/2、JNK1/2和p38信號通路進(jìn)行檢測。IL-1β、IL-6和IL-8被認(rèn)為是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者［17］，所以選取炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8進(jìn)行檢測。

ERK信號通路的相關(guān)結(jié)果如圖2所示，TPM染毒組的磷酸化ERK1/2表達(dá)水平以及細(xì)胞上清液中的炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8釋放水平均顯著升高。為進(jìn)一步探究ERK1/2信號通路是否參與調(diào)控卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放，進(jìn)行了ERK1/2信號通路抑制實(shí)驗(yàn)，在TPM染毒下的ERK1/2特異性抑制劑組中，磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)明顯被抑制，且細(xì)胞上清液中的IL-1β、IL-6和IL-8釋放水平相較于無抑制劑處理的TPM染毒組也顯著減少。ERK1和ERK2信號通路在調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放中具有重要作用［18］。有研究［14］表明，卷煙煙氣和脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放是通過激活ERK信號通路來實(shí)現(xiàn)的，抑制ERK可顯著緩解炎癥；本研究的結(jié)果與其結(jié)果一致。Shin等［19］通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了抑制ERK信號通路可緩解卷煙煙氣誘導(dǎo)的肺部炎癥。ERK1/2可通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，而ERK1/2激活下游的TPL2信號通路對炎癥因子的釋放具有復(fù)雜的效應(yīng)［18］，既可刺激Toll樣受體（TLR）進(jìn)而誘導(dǎo)TNF、IL-1β和IL-10的釋放［20］，又可下調(diào)IL-12、干擾素β（IFN-β）和iNOS的產(chǎn)生［21］。

JNK信號通路具有促進(jìn)炎癥的作用，抑制JNK可能會成為炎癥相關(guān)疾病的有效治療手段［22］。Tian等［23］發(fā)現(xiàn)了一種新的治療手段，可以明顯抑制小鼠肺泡灌洗液中單核細(xì)胞趨化蛋白（Monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、IL-2、IL-6和IL-10的釋放水平，并減少肺組織中JNK和p38蛋白的mRNA水平，該方法可能會減輕卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥。在本研究中，JNK1/2相關(guān)結(jié)果（圖3）顯示TPM染毒組的磷酸化JNK1/2水平顯著升高；在TPM染毒下的JNK1/2特異性抑制劑組中，磷酸化JNK1/2蛋白被明顯抑制，細(xì)胞上清液中的 IL-1β、IL-6和IL-8釋放水平也顯著下降。該結(jié)果從體外實(shí)驗(yàn)水平證明了卷煙煙氣誘導(dǎo)的肺細(xì)胞炎癥受JNK1/2信號通路調(diào)節(jié)。有研究［18］表明，很多刺激均可以通過激活上游信號通路MAP3K-MAP2K來激活JNK1/2信號通路，但是探究JNK1/2信號通路在后續(xù)炎癥反應(yīng)中的生理學(xué)機(jī)制較為困難，因?yàn)樵摰鞍椎娜笔?dǎo)致胚胎死亡。Martinez等［22］發(fā)現(xiàn)選擇性敲除JNK1/2的骨髓細(xì)胞會減少巨噬細(xì)胞中部分M1型巨噬細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，這些基因是體外IFN-γ和脂多糖刺激致病的關(guān)鍵基因，該結(jié)果表明巨噬細(xì)胞中JNK1/2信號通路具有促炎癥作用。

圖2ERK1/2參與調(diào)控TPM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥因子的釋放Fig.2 ERK1/2-regulated release of inflammatory cytokines in BEAS-2B cells induced by TPM

圖3 JNK1/2參與調(diào)控TPM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥因子的釋放Fig.3 JNK1/2-regulated release of inflammatory cytokines in BEAS-2B cells induced by TPM

圖4 p38參與調(diào)控TPM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥因子的釋放Fig.4 p38-regulated release of inflammatory cytokines in BEAS-2B cells induced by TPM

本研究中進(jìn)一步探究了p38信號通路在卷煙煙氣誘導(dǎo)的肺細(xì)胞炎癥中的作用，結(jié)果（圖4）顯示，在TPM染毒組中，磷酸化的p38蛋白水平相較于對照組顯著升高；在TPM染毒下，加入p38的特異性抑制劑后，磷酸化的p38蛋白表達(dá)被抑制，細(xì)胞上清液中的IL-1β、IL-6和IL-8釋放水平也被顯著抑制。由于p38信號通路可以通過激活負(fù)反饋信號通路抑制TLR信號通路來調(diào)控炎癥，所以其在促炎癥因子的產(chǎn)生中具有獨(dú)特的作用［18］。Kang等［24］發(fā)現(xiàn)在p38缺失的小鼠肝臟組織內(nèi)，炎癥因子和趨化因子均顯著升高，并募集更多的炎癥細(xì)胞，表明在急性肝炎中p38信號通路起到了抗炎的保護(hù)作用；相反地，在人脂肪細(xì)胞中，脂多糖誘導(dǎo)的炎癥是通過激活p38/NF-κB信號通路來實(shí)現(xiàn)的［25］。由此可以看出，p38信號通路在不同化合物的染毒以及不同暴露部位下可能發(fā)揮著不同的作用。

卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥不僅受MAPK信號通路的調(diào)節(jié)，還受到其他信號通路的調(diào)控。Rom等［26］綜述了在免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞體系下，卷煙煙氣和煙氣提取物可通過NF-κB信號通路來誘導(dǎo)呼吸道炎癥和慢性阻塞性肺病等相關(guān)疾病；Jiang等［27］發(fā)現(xiàn)卷煙煙氣首先激活Rac1信號通路，然后調(diào)節(jié)ERK1/2和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal transducers and activator of transcription 3，STAT3）信號通路來誘導(dǎo)小鼠肺細(xì)胞中IL-6和炎癥趨化因子的釋放，最終導(dǎo)致炎癥發(fā)生；Nguyen等［28］發(fā)現(xiàn)Nrf2（NF-E2-related factor 2）信號通路參與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和肺部炎癥的調(diào)控。這些信號通路與MAPK信號通路均參與了卷煙煙氣誘導(dǎo)的肺細(xì)胞炎癥的發(fā)生。炎癥相關(guān)信號通路之間的相互關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

①卷煙煙氣染毒可以引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞炎癥因子（IL-1β、IL-6和IL-8）的釋放；②卷煙煙氣染毒可激活ERK1/2、JNK1/2和p38信號通路；③MAPK信號通路可調(diào)節(jié)卷煙煙氣誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放。該研究結(jié)果可為煙草制品健康風(fēng)險評估提供理論參考。