β連環蛋白在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用機制研究

方天富 王麗 郭寶亮

[摘 要] 目的 探討肝硬化大鼠心肌中的β連環蛋白（β-catenin）表達，以闡明β-catenin在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用機制。方法 建立肝硬化大鼠模型，通過模型組和對照組比較，免疫組化法檢測各組心肌組織中β-catenin表達水平;Western blot檢測大鼠心肌中的β-catenin和Wnt誘導的分泌型蛋白1（WISP-1）表達差異。結果 模型組體重增長較慢，且小于對照組。免疫組化及Western blot結果顯示對照組β-catenin蛋白的表達水平低，肝硬化模型組β-catenin蛋白的表達水平高，二者比較差異有統計學意義（P<0.01）。結論 Wnt/β-catenin（Wnt/β-連環蛋白）信號通路參與肝硬化所致心肌肥厚的病理過程。

[關鍵詞] 肝硬化;SD大鼠;心肌肥厚;Wnt/β-連環蛋白信號通路

中圖分類號：R542.2;R575.2

文獻標識碼：A

文章編號：1009-816X（2019）03-0237-03

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.03.012

國內外研究表明，在肝硬化患者中存在心肌異常，包括心肌肥厚、心肌細胞水腫、纖維化和滲出、細胞核空泡樣變性。肝硬化患者心肌肥厚多發生于肝硬化早期，組織形態學改變包括心肌肥大、細胞間質和細胞內水腫、細胞損傷等，多表現為左心房心室肥大，左心室壁廣泛變厚，且對室間隔壁的影響超過游離壁。已有研究發現肝硬化患者冠心病的風險明顯增大[1]。早期肝硬化心肌病（cirrhotic cardio myopathy，CCM）缺乏統一的診斷標準，因此目前缺乏有關CCM的流行病學數據[2]。

Wnt/β-連環蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路近年備受關注，Wnt誘導的分泌型蛋白1（WISP-1）受Wnt/β-catenin水平的調控，WISP-1是一個促進增生及纖維化的生長分子。Wnt/β-catenin信號通路除參與正常的生理過程外，還參與腫瘤發生和創傷修復過程，并在心臟發育過程中起雙重作用，其穩定表達促進早期心肌細胞的產生，而抑制其表達是發育晚期心肌細胞分化所必須的。本研究旨在探討肝硬化大鼠心肌中的β-catenin表達，以闡明Wnt/β-catenin信號通路在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器：SD雄性大鼠購自上海斯萊克有限公司，SCXK（滬）2017-0005，四氯化碳，茶油，β-catenin antibody一抗（abcam公司），二抗、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），蘇木素（Sigma公司），顯微鏡：BX43型（OLYMPUS公司）。

1.2 方法：

1.2.1 肝硬化模型的構建：將23只SD大鼠隨機分為模型組（15只）與對照組（8只），模型組按0.20mL/100g劑量腹腔注射40%四氯化碳茶油溶液，每周2次，連續8周。對照組給予相同濃度的食用油溶液腹腔注射。模型組和對照組同時以10%乙醇溶液為其唯一飲用水源。

1.2.2 超聲心動圖檢測：對各組大鼠使用超聲診斷儀進行檢測，腹腔注射氯胺酮，將大鼠麻醉，胸部備皮后使用6-12MHz高頻線陣探頭每周經胸骨旁左心室長軸切面及腹主動脈的長軸切面連續檢測室間隔舒張末期厚度（IVSTd），左心室后壁舒張末期厚度（LVPWTd）及左心室舒張末期內徑（LVDd）。

1.2.3 免疫組化方法：至8周時，模型組隨機取材3只大鼠肝臟做HE染色，證實肝硬化大鼠模型復制成功后取各組大鼠心尖組織給予脫蠟、復水、孵育、沖洗。分別滴加一抗，二抗孵育過夜（設置PBS替代一抗作為陰性對照）后染色，干燥封片。置于顯微鏡下觀察，每張切片隨機選3個不同視野（×200）觀察，判讀陽性表達強度和陽性率。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western Blot）：剪切各組織于1.5離心管中，PBS洗一遍。收集細胞后，提取細胞總蛋白，BCA法測定其濃度。取50/lg蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），轉膜，分別用一抗和二抗與膜進行雜交反應。電泳后采用化學光敏模式進行曝光顯影。ID數碼成像分析系統軟件（美國Bio-RAD公司）對Western印跡結果進行定量分析，積分吸光度值（IA）表示灰度值。

1.3 統計學分析：采用SPSS19.0版軟件，計量資料用（x -±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠體重比較：模型組體重增長較慢，且小于對照組（P<0.05），見圖1。

2.2 超聲心動圖結果：造模后，模型組大鼠IVSTd，LVPWTd及LVDd與對照組比較均有顯著性變化，見表1。

2.3 HE染色結果：對照組心肌結構正常，細胞排列規則;模型組心肌組織結構松散，細胞排列紊亂，細胞間隙增大，部分心肌細胞肌絲溶解，有少量中性粒細胞浸潤，細胞壞死或空泡化，圖2見插頁。

2.4 β-catenin免疫組化結果：β-catenin呈褐色或黃褐色表達，主要存在細胞膜，部分表達于胞漿。結果顯示，β-catenin陽性表達模型組高于對照組，圖3見插頁。

2.5 Western blot結果：模型組β-catenin蛋白表達高于對照組，二者差異有統計學意義（P<0.01），見圖4。

3 討論

隨著大量研究表明，肝硬化患者存在外周血管阻力下降、動脈壓降低，心率、血容量、心輸出量增加，這種高動力狀態可由外周血管阻力下降、血容量分布異常、血管活動物質水平異常、神經體液調節紊亂引起，進一步導致心肌結構異常。肝硬化患者心肌對刺激的反應和心肌收縮力減弱，在應激狀態下更為明顯，嚴重時導致心力衰竭，該現象稱為肝硬化心肌病（CCM）。但是因肝硬化患者外周血管阻力減小，心臟后負荷顯著下降，從而掩蓋嚴重心功能衰竭表現，導致臨床表現隱匿[3]。

Wnt信號通路的主要成分包括：分泌蛋白Wnt家族，跨膜受體Frizzled家族，CK1，Deshevelled，GSK3，APC，Axin，β-catenin以及轉錄因子TCF/LEF家族。Wnt信號通路認為它包括三個分支：經典Wnt信號通路;Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。Wnt信號途徑能引起細胞β-catenin積累。游離的β-catenin可進入細胞核，調節基因表達。

心臟對容量或壓力超負荷可表現出適應性反應，通常是心肌肥厚。研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統及RAS/RAF/MEK/ERK、RAF/NF-KB等信號傳導及體液因素是重要原因。Wnt信號水平的高表達在某些病理情況下對心肌重塑也發揮著重要作用[4，5]。β-catenin是一種多功能蛋白質，作為經典Wnt信號通路的第二信使，在肥厚因素刺激下，能引起心肌肥厚[6]。Baurand等[7]卻發現，在研究血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥厚的小鼠模型中，β-catenin基因敲除組的心肌肥厚較β-catenin穩定表達組更顯著。

根據國內外的研究，本文想到對于肝硬化患者是否Wnt信號通路在其引起的心肌肥厚病理變化中亦起重要作用。本研究表明兩組比較，模型組體重增長較慢，且小于對照組。免疫組化及Western blot結果顯示對照組β-catenin蛋白的表達水平低于模型組，二者比較有較顯著性差異（P<0.01）。β-catenin在肝硬化所致心肌肥厚的病理過程中發揮了一定的作用。

本研究顯示早期干預阻斷，可減輕肝硬化患者的心臟病理及生理改變，從而為廣大肝硬化患者的治療帶來更廣闊的前景。

參考文獻

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[2]Gassanov N， Caglayan E， Semmo N， et al. Cirrhotic cardiomyopathy： A cardiologists perspective[J]. World J Gastroenterol，2014，20（42）：15492-15498.

[3]Moller S， Krag A， Bendtsen F. Kidney injury in cirrhosis： patho-physiological and therapeutic aspects of hepatorenal syndromes[J]. Liver Int，2014，34（8）：1153-1163.

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[5]Zelarayan LC， Noack C， Zafiriou MP， et al. Wnt signaling molecules in left ventficular remodeling： focus on dishevlled 1[J]. Hypertension，2010，55（4）：852-854.

[6]Duan J， Gherghe C， Liu D， et al. Wntl/betacatenin injury re-sponse activates the epieardium and cardiac fi bmblasts to pro-mote cardiac repair[J]. EMBO J，2012，31（2）：429-442.

[7]Baurand A， Zelarayan L， Betney R， et al. B-catenin downregulation is required for adaptive cardiac remodeling[J]. CircRes，2007，100（9）：1353-1362.

（收稿日期：2018-11-26）