基于mRNA和miRNA芯片探索影響結直腸癌肝轉移的靶基因

蘇軼男

結腸直腸癌（CRC）是世界上第三種最常見的惡性腫瘤，也是導致癌癥相關死亡的第四大原因[1]。據估計，全世界每年約有130 萬CRC 新發病例和近70 萬死亡病例[2]，CRC 的發病率和死亡率隨年齡增長而增加[3]。盡管CRC 診斷和治療方法有所改善，但超過50%的患者在治療后仍會出現轉移[4]。肝臟是CRC 轉移最常見的靶向器官，肝臟轉移被認為是CRC 最致命的進展之一，同時肝轉移是最關鍵的預后風險因素[5]。原發性CRC患者術后5年生存率為69.5%～95.7%，而CRC 肝轉移患者的術后5年生存率降至27%～41%[6]。因此，盡早發現CRC肝轉移對于患者的預后至關重要。轉移是通過多步驟事件來實現的，并且一些mRNA 和miRNA 被認為與肝轉移相關，例如金屬蛋白酶1 組織抑制劑（TIMP-1）[7]和miRNA-21[8]。然而，目前CRC中肝轉移的相關機制仍然不清楚，生物標志物欠缺。本研究分析了GEO數據庫中關于CRC 肝轉移的miRNA 和mRNA 表達譜數據，以期能夠找到影響CRC 肝轉移的相關基因，為CRC的實驗和臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 芯片數據 本研究所用的數據集均來源于NCBI 的GEO數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[9]。mRNA表達數據編號為GSE30687，包括2個原發性CRC樣本和2個CRC肝轉移樣本，檢測平臺為GPL571[HG-U133A_2]Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array。miRNA 表達數據編號為GSE44121，包括9 個原發性CRC 樣本和9 個發生肝轉移的CRC 樣 本 ，基 于 GPL16231 Nanostring nCounter Human microRNA Expression Platform芯片進行檢測。

1.2 芯片數據預處理 基于R軟件（版本號：3.6）中的affy軟件包（版本號：1.62.0）[10]，首先將mRNA的原始數據轉換成R語言中可識別格式。然后，通過Robust-Multi-Array（RMA）方法[11]進行背景矯正和標準化處理，最終得到標準化后的表達值矩陣，用于后續的差異表達分析。對于miRNAs數據，首先得到它們的表達值矩陣數據，再通過preprocess Core 函數包（版本號：1.46.0）對數據進行標準化處理。

1.3 差異表達mRNAs 和miRNAs 的篩選 通過與原發性CRC標本相比較，利用limma函數包篩選出肝轉移CRC樣品中的差異表達mRNAs 和miRNAs。篩選閾值為P＜0.05 和|log2FC|＞0.5。此外，在樣品中進行了差異表達mRNAs的雙向聚類分析。

1.4 基因功能富集分析 利用DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/）在線工具對差異表達mRNA 進行GO 功能和KEGG通路富集分析，最顯著的GO功能和KEGG通路篩選標準為P＜0.05。

1.5 miRNA-mRNA 調控網絡構建 本研究利用TargetScan預測差異表達miRNA 可能調控的靶基因，形成miRNA-mRNA 調控關系對，并且篩選出包含差異表達mRNA 的miRNA-mRNA 關 系 對[12]，利 用 Cytoscape 軟 件[13]構 建miRNA-mRNA 調控網絡圖。此外，篩選出“節點度”≥1 的基因?！肮濣c度”是指與該基因相關聯的基因數。

2 結果

Fig.1 The two-way cluster graph of DEGs and four samples圖1 差異表達mRNA和4個樣本的雙向聚類圖

2.1 差異表達mRNA 和miRNA 在CRC 肝轉移樣本中發生差異表達的mRNAs 共180 個，其中表達下調的有116個，表達上調的有64個，其與mRNA表達數據中的4 個樣本的雙向聚類圖，見圖1。此外，與原發性CRC 樣本相比，CRC 肝轉移樣本中的差異表達miRNAs共15個，其中6個miRNAs表達上調，9個miRNAs 表達下調。前30 個最顯著的差異表達的mRNAs見表1；所有的差異表達miRNAs見表2。

Tab.1 The top 30 most significant differential expression mRNAs in CRC samples with liver metastasis表1 結直腸癌肝轉移樣本中前30個最顯著的差異表達mRNAs

2.2 功能富集分析 差異表達mRNAs富集于32個GO terms，其中包括11 個細胞組分（CC）、13 個生物學過程（BP）和8 個分子功能（MF）。根據P值由小到大排列篩選出的前10個GO terms，見表3。另外，這些差異表達mRNAs 主要富集在包括類固醇生物合成（steroid biosynthesis）和霍亂弧菌感染（vibrio cholerae infection）在內的2條通路中，見表4。

Tab.2 The differential expression miRNAs in CRC samples with liver metastasis表2 結直腸癌肝轉移樣本中差異表達miRNAs

2.3 miRNA-mRNA 調控網絡 首先獲得了由差異表達 miRNAs 調節的 555 個 miRNA-mRNA 關系對，其中差異表達mRNAs 參與的關系對為50 個?；谠?0 個miRNA-mRNA 關系對構建了miRNA-mRNA網絡圖，見圖2。具有較高節點度的前8個基因，包括纖連蛋白1（FN1）和骨髓嗜病毒整合位點1（MEIS1）等，見表5。

Tab.3 The top 10 enriched GO terms of differential expression mRNAs according to the P-value表3 根據P值篩選的差異表達mRNA富集的前10個GO terms

Tab.4 The enriched KEGG pathway of differential expression mRNAs表4 差異表達基因富集的KEGG通路

Fig.2 The miRNA-mRNA network圖2 miRNA-mRNA網絡圖

Tab.5 The top 8 genes with higher degree in the miRNA-mRNA network表5 miRNA-mRNA網絡圖中具有較高節點度的前8個基因

3 討論

本研究結果顯示，與原發性CRC 標本相比，在具有肝轉移的CRC 標本中篩選出了差異表達mRNAs，并且它們主要富集于生物轉化和質量相關的GO terms 中（表3），例如陰離子轉運和脂肪酸生物合成。此外，前3 個最重要的生物學過程是陰離子轉運（anion transport）、維生素A 應答（response to vitamin A）和脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthetic）。陰離子轉運在物質代謝和藥物作用中起著關鍵作用，例如有機陰離子轉運蛋白（OAT）主要參與調控許多小有機陰離子分子通過上皮屏障和體液隔室中的跨細胞運動[14]。人類小管多特異性OAT 在各種人類癌細胞中表達，包括CRC 細胞和耐藥細胞[15]。OAT2 被認為是預測尿嘧啶-替加氟加亞葉酸（UFT/LV）治療方案對CRC 患者治療效果的生物標志物[16]。有機陰離子轉運多肽1A2（OATP1A2）和有機陽離子轉運蛋白6（OCT6）是三陰性乳腺癌對新輔助化療方法病理反應的預測因子[17]。本研究結果顯示肝轉移的CRC 樣品中篩選出的差異表達mRNA 主要富集于陰離子轉運過程，表明陰離子轉運相關的生物學過程可能與CRC 的肝轉移有關。部分研究發現，維生素A 可以促進CRC 細胞凋亡[18]。另有研究認為，脂肪酸攝入是CRC的危險因素[19]，脂肪酸分布影響CRC的預后效果[20]。本文研究顯示維生素A應答和脂肪酸生物合成是差異表達mRNA 主要富集的生物學過程，提示維生素A應答和脂肪酸生物合成相關的生物學過程與CRC 的預后有關，并且對它們的探索可能有助于篩選作為CRC診斷和治療的一些生物標志物。

CRC 是一種雌激素依賴性惡性腫瘤，類固醇硫酸酯酶可以控制組織內雌激素濃度。部分研究顯示，CRC 中的類固醇硫酸酯酶表達可能會降低[21]。另一項研究發現，類固醇生物合成參與CRC 從腺瘤到癌的進展過程[22]。此外，一些性類固醇受體的遺傳變異也可能與CRC流行病學的性別差異有關[23]。雖然很少有研究探討霍亂弧菌感染與CRC 之間的關系，但通常認為病毒感染可能會增加患CRC 的風險[24]。 曹 燕 青 等[25]研 究 認 為 ，乙 型 肝 炎 病 毒（hepatitis B virus，HBV）感染降低了左半結直腸癌肝轉移的風險，并提高了肝轉移病灶的手術切除率。在本研究中，筆者發現差異表達mRNA 主要富集于類固醇生物合成和霍亂弧菌感染相關通路中，表明類固醇生物合成和霍亂弧菌感染可能會影響CRC的肝轉移。然而，有必要進一步探討這些通路是如何影響CRC肝轉移的。

在構建的miRNA-mRNA 網絡圖中，FN1和MEIS1是節點度最高的兩個基因。FN1基因編碼纖維連接蛋白1，該蛋白可促進口腔鱗狀細胞癌的轉移[26]。FN1的轉錄激活也可促進CRC 的惡性行為，包括轉移[27]。FN1的表達與結直腸癌的進展和轉移密切有關[28]。此外，FN1是肝細胞癌轉移的潛在靶點[29]。因此，FN1基因可能是 CRC 肝轉移的潛在生物標志物。MEIS1是一個同源框基因，其調節髓樣白血病的腫瘤發生和預后過程[30]。研究表明MEIS1基因在結直腸癌中表達下調，其是結直腸腫瘤發生的生物標志物，并且MEIS1可能在CRC 中起到腫瘤抑制劑的作用[31]。此外，在BRAF基因發生突變的CRC 中MEIS1啟動子發生顯著的甲基化，其與MEIS1表達降低有關[31]。本研究結果顯示，MEIS1是肝轉移的CRC 樣品中非常重要的一個差異表達mRNA，表明MEIS1可能參與了CRC的肝轉移，盡管很少有研究可以證明這一點。

綜上所述，FN1和MEIS1可能是 CRC 肝轉移的潛在生物標志物，但需要進一步的實驗和臨床研究來證明。此外，一些生物過程（例如陰離子轉運、維生素A應答和脂肪酸生物合成）和通路（例如類固醇生物合成和霍亂弧菌感染）可能與CRC 的肝轉移有關。