PTD-FNK蛋白對豬精子的冷凍保護作用及其機制

李丹丹 劉蛟 王英群

摘要：為評估PTD-FNK蛋白對豬精子凍后質量的影響，以探討其可能的作用機制。在豬精液冷凍稀釋液中添加不同濃度（0、0.1、1、10、100 nmol/L）的PTD-FNK蛋白，采用精子圖像分析儀分析凍后豬精子的質量，使用流式細胞儀檢測凍后精子Annexin V-FITC/PI染色后的凋亡情況，利用相對熒光定量PCR和多功能酶標儀檢測不同凋亡途徑中精子相關基因的表達量變化或含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的活性和染色后線粒體mPTP開放性。結果表明，與對照組相比，10 nmol/L PTD-FNK蛋白試驗組豬精子凍后活性、活率和頂體完整率均顯著升高（P<0.05，P<0.01），凋亡率和Bax、caspase-3、caspase-9基因表達量、caspase-9蛋白酶活性、mPTP開放性均顯著降低（P<0.05）。說明PTD-FNK可能通過線粒體內源性凋亡途徑抑制凍融豬精子的凋亡。

關鍵詞：PTD-FNK;豬;精子;凋亡;冷凍保護

中圖分類號： S828.3+4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0217-05

隨著人工授精技術成為現代常見的輔助生殖技術，冷凍精液技術得到廣泛應用，提高冷凍精液質量也就成為當今研究熱點。自1975年起，豬精子冷凍方面的研究開始出現，近幾年豬精液冷凍快速發展，技術不斷提高，但在公豬育種的商業化進程中未取得相應的進展[1]，且豬冷凍精液的人工授精使用率僅約1%。精子在液氮保存下，代謝水平低，其活力幾乎處于停滯水平，解凍后能使其恢復活力而又不失去在母畜體內的受精能力。但低溫冷凍對精子的損傷較大，導致精子活力降低，僅有50%的精子存活，而存活的精子活力不能達到人工授精標準[2]。豬精液對環境變化非常敏感[3]，技術仍有許多急需攻克的難關，與實際生產應用仍有一定差距，所以關于改進豬精子低溫保存條件，發現冷凍保存破壞精子細胞功能的機制就成為現今需要解決的問題。在人工受精的應用上，冷凍精液與新鮮精液相比，受胎率和窩產仔數都出現下降現象。因此，為提高凍后精子質量，應尋求一種更為有效的稀釋液。

PTD-FNK蛋白是人工構建的抗凋亡蛋白[4]，其對不同類型細胞（神經元、軟骨細胞、肝細胞、骨髓單核細胞等）受到的多種損傷刺激都有較好的防御作用，包括保護冷凍、解凍對細胞的損傷[5]。添加300 nmol/L PTD-FNK蛋白是有效提高豬精子抗凍能力的方法[6]，但其蛋白產量小且用量多。故本實驗室經過多重努力，成功構建并可溶性表達PTD-FNK蛋白，得到有生物活性的PTD-FNK蛋白[7]。

根據含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）不同激活途徑，將凋亡激活途徑分為3種，死亡受體途徑（caspase-8）、線粒體途徑（caspase-9）以內質網途徑（caspase-12）[8]。內源性線粒體途徑主要通過活化caspase-9，進一步激活caspase-3而產生caspase的一系列級聯效應;外源性死亡受體途徑，影響因子主要包括Fas和TNF等，產生有活性的caspase-8激活下游caspase級聯效應;與線粒體途徑同屬于內源性細胞凋亡途徑的內質網途徑，通過內質網的應激反應已經對鈣離子的調控參與細胞凋亡活動[9]。3個途徑共同參與凋亡信號的傳導，引起細胞嚴重凋亡。本研究通過Annexin V-FITC/PI染色法檢測細胞凋亡，相對熒光定量PCR技術檢測不同凋亡途徑中相關凋亡基因的表達量，借助caspase的活性初步判斷PTD-FNK保護凍融精子的路徑，并進一步檢測該路徑膜孔道的變化，進而分析確定PTD-FNK保護凍融豬精子的主要途徑，初步探索PTD-FNK蛋白對凍融精子的保護機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

PTD-FNK蛋白，由廣西大學動物科學技術學院解剖實驗室保存提供。caspase-8、caspase-9熒光檢測試劑盒，購自江蘇凱基生物技術股份有限公司;caspase-12 Fluorometric Assay Kit，購自BioVision公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒和細胞線粒體分離試劑盒，均購自碧云天生物技術研究所;純化線粒體膜通道孔（mPTP）熒光檢測試劑盒，均購自美國Genmed公司;FITC Apoptosis Detection KitⅠ，購自美國BD公司;HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;SYBR Premix DimerEraserTM（Perfect Real Time），購自TaKaRa公司。

Digitcool程序化自動冷凍儀及SCA自動精液分析儀，購自法國卡蘇公司;SD-2數碼液晶顯微鏡，購自深圳泰宇星光電儀器有限公司;Tecan Infinite 200 Pro多功能酶標儀，購自瑞士Tecan公司;BD AccuriTM C6流式細胞儀，購自美國BD公司;CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測系統，購自BIO-RAD公司。

1.2 精液采集

精液采自廣西科達畜禽改良有限責任公司的健康、正常采精的長白（Landrace）種公豬。經常溫稀釋液1 ∶ 1等溫稀釋后，0.5 h內運至廣西畜禽品種改良站實驗室進行后續試驗。選取鏡檢活力>0.8的精液，冷凍保存。

1.3 冷凍稀釋液配制

冷凍基礎液（TCG）：葡萄糖60 nmol/L，檸檬酸 75 nmol/L，Tris 200 nmol/L，1%青鏈霉素，調節pH值至6.8，0.22 μm濾器過濾后置于4 ℃保存。冷凍Ⅰ液：將80%TCG液和20%卵黃液（新鮮卵黃10 000 r/min離心15 min后取上清液待用）充分混合攪拌均勻;取冷凍Ⅰ液，分別加入PTD-FNK蛋白，使得PTD-FNK蛋白終濃度為0.1、1、10、100 nmol/L。冷凍Ⅱ液：91%TCG液與9%甘油上下顛倒充分混合。

1.4 精液的冷凍與解凍

將精液1 200 r/min離心6 min，去上清，取精液與冷凍Ⅰ液等體積混勻，置于常溫下孵育30 min，加入同等體積的冷凍Ⅱ液，使精液、冷凍Ⅰ液和冷凍Ⅱ液的比例為1 ∶ 1 ∶ 1，分裝于0.25 mL塑料細管封口，2 h內按預設溫度梯度降溫至 5 ℃，置5 ℃平衡2 h。將細管取出，檢查平衡后活力合格，放入程序降溫儀內，程序運行結束后，馬上將細管投入液氮保存。解凍時，將細管投入62 ℃水中5 s，輕輕晃動。擦除表面水珠，并剪開兩端。

1.5 精子質量檢測

1.5.1 精子活力、活率 各取10 μL凍融精液于37 ℃預熱的載玻片上，使用精子圖像分析儀進行分析。

1.5.2 頂體完整性 取凍后精子于3.7%多聚甲醛中固定，考馬斯亮藍染色后，取20 μL精子懸液置于血球計數板上，隨機選取400×普通光學顯微鏡5個視野進行觀察，計算200個以上精子的頂體完整率。

1.5.3 質膜完整性 取果糖-檸檬酸鈉低滲溶液稀釋將解凍后的精子稀釋，并將精子密度調整為1×106個/mL，37 ℃下孵育30 min后，取20 μL精子懸液置于血球計數板上，隨機選取400×普通光學顯微鏡5個視野進行觀察，計數200個以上精子的質膜完整性。

1.6 FITC Annexin V/PI雙標記檢測精子凋亡

根據FITC Annexin V/PI雙標記試劑盒說明，預冷PBS洗滌精子2次后，以1×的結合緩沖液重懸精子，并調整細胞濃度為1×106個/mL。取100 μL精子懸液，分別加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI混勻，避光室溫孵育15 min，再加入400 μL 1×結合緩沖液，利用流式細胞儀檢測每個精子的前向角散光（ESC）和側向角散光（SSA）。用波長為520 nm通帶濾器檢測FITC熒光（FL1），波長>610 nm濾器檢測PI（FL3），每樣本收集20 000個精子熒光信號。采用BD AccuriTM C6自帶軟件初步分析，Flow-jo軟件分析流式結果并作圖。

1.7 總RNA提取和反轉錄

取凍融后的精子，用Trizol法提取RNA，RNase free ddH2O溶解，測D260 nm值為1.8～2.0可用。用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR[+gDNA wiper（基因組消除酶）]進行反轉錄，樣品于 -80 ℃ 保存待用。

1.8 qRT-PCR

選取NCBI上豬精子凋亡部分基因的cDNA序列設計引物，以β-actin為基因。相關引物信息見表1。用SYBR Premix DimerEraserTM進行Real Time PCR。反應體系：SYBR Premix DimerEraser（2×）12.50 μL，上、下游引物各0.75 μL，cDNA模板2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL體系。反應條件：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，退火30 s（Tm均為60 ℃），72 ℃ 延伸30 s，45個循環，退火并收集熒光，每個樣品重復3次。

1.9 凍融精子Caspase蛋白酶活性檢測

取凍融后的精子，PBS洗滌2次，調整細胞數為5×106個，加入200 μL預冷的裂解液，充分裂解離心后使用BCA法測定蛋白濃度。吸取30 μL含100 μg蛋白的裂解液上清，參照caspase熒光檢測試劑盒加入反應液，37 ℃下孵育1.5 h，使用多功能酶標儀測定3條通路關鍵caspase（caspase-8、caspase-9、caspase-12）的熒光強度（激發 λ=485 nm，發射λ=535 nm）。

1.10 凍融精子線粒體膜通道孔開放性檢測

取凍融后的精子，預冷PBS洗滌后，參照線粒體分離試劑盒說明進行精子線粒體的提取，取100 μL線粒體樣本（總含量0.2 mg），按照純化線粒體膜通道孔熒光檢測試劑盒說明加入反應液染色，移取100 μL懸液到黑色96孔板，置于多功能酶標儀中檢測RFU的變化（激發λ=488 nm，發射λ=525 nm）。

1.11 數據處理

數據采用SPSS 22.0進行多重分析，試驗結果以“x±s”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。采用Excel軟件和Flow jo軟件分析結果并作圖。qRT-PCR以 β-actin 作為內參基因，試驗組各基因的相對表達量采用2-ΔΔCT法計算。

2 結果與分析

2.1 PTD-FNK蛋白對豬精子凍后質量的影響

由表2可知，與對照組精子活力相比，0.1 nmol/L組無顯著差異（P>0.05），1、10、100 nmol/L組顯著升高（P<0.05）。與對照組活率相比，0.1 nmol/L組無顯著差異（P>0.05），1、100 nmol/L組顯著升高（P<0.05），10 nmol/L組有極顯著升高（P<0.01）。與對照組相比， 0.1、 1、100 nmol/L組的頂體完整率無顯著差異（P>0.05），10 nmol/L組顯著升高（P<0.05）。與對照組精子質膜完整性相比，各試驗組均無顯著差異（P>0.05）。

2.2 PTD-FNK蛋白對凍后精子凋亡的影響

由圖1可知，其中Q1：AV+-PI+內為已經壞死的精子，Annexin V和PI均為陽性，該象限內精子質膜的完整性還是在一定程度上得到維持但質膜滲透性受到損傷;Q2：AV--PI+為凋亡晚期精子，該象限內精子質膜結構可能已被打破或丟失，質膜結構已不完整，導致Annexin V反應呈現陰性;Q3：AV+-PI-為凋亡早期精子，有活性的精子，Annexin V為陽性而PI為陰性，該象限內的精子仍處于完整的質膜結構狀態，但是質膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）部分已經開始轉移到細胞膜的外側，呈現出早期凋亡狀態;Q4：AV--PI-為凋亡早期精子，Annexin V和PI均為陰性，該象限內質膜的結構和功能都保持完好。可見，添加PTD-FNK蛋白10 nmol/L試驗組的凋亡率（Q2+Q3）顯著低于對照組（P<0.05）。

2.3 PTD-FNK蛋白對凍后精子凋亡相關基因mRNA表達的影響

采用β-actin基因作為管家基因，對照組各基因mRNA的相對表達量均以1表示，比較各試驗組與對照組凋亡相關基因mRNA表達的差異。由圖2可知，10 nmol/L試驗組caspase-3及caspase-9表達量顯著下降（P<0.05），Bax表達量極顯著下降（P<0.01），死亡受體通路關鍵基因 csapase-8表達量與對照組相比無顯著差異（P>0.05）。

2.4 PTD-FNK蛋白對凍后精子caspase活性的影響

由圖3可知，與對照組相比，10 nmol/L試驗組凍后精子線粒體通路關鍵蛋白酶caspase-9活性顯著下降（P<0.05），而死亡受體通路關鍵蛋白酶caspase-8及內質網通路關鍵蛋白酶caspase-12活性無顯著差異（P>0.05）。

2.5 PTD-FNK蛋白對凍后精子mPTP通道開放性的影響

由線粒體膜內外成分構成的線粒體膜通道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是非特異性鈣離子依賴性通道。在凋亡細胞，線粒體內容物可通過mPTP釋放到胞漿中。線粒體膜通道的持續開放可導致細胞色素C釋放至細胞漿中，并造成細胞線粒體跨膜電位的降低。鈣黃綠素-AM是一種熒光探針，當探針進入線粒體后會被內酯酶切離而被線粒體俘獲，從而產生熒光較強的鈣黃綠素。存在于線粒體外的鈣黃綠素可以利用離心或者鈷離子淬滅，檢測線粒體內鈣黃綠素熒光強度變化可以間接表明mPTP開放程度。由圖4可知，與對照組相比，10 nmol/L PTD-FNK蛋白組凍后精子線粒體膜通道孔開放性檢測結果RFU值顯著升高（P<0.05）。

3 討論

本試驗從凍融精子的表觀質量出發，以Annexin V/PI染色及mRNA表達量為基礎，篩選PTD-FNK蛋白對冷凍子保護的最優濃度，通過caspase的活性初步篩選PTD-FNK保護凍融精子的路徑，并進一步檢測該路徑膜通道的變化，初步探索PTD-FNK蛋白對凍融精子的保護機制。有研究表明，凍融豬精子質膜、頂體和線粒體等結構發生變化，精子結構的完整性遭到一定程度破壞，影響到了精子的正常代謝及正常生理功能的發揮，進而影響到受精能力[10]。由表2可知，與對

照組相比，PTD-FNK蛋白的凍融豬精子的活力、活率、頂體完整率均顯著升高，說明10 nmol/L PTD-FNK蛋白就能夠有效保護凍融豬精子。而當其濃度升高至 100 nmol/L 時，與對照組并無顯著性差異。這與Shimokawa等研究的 300 nmol/L 的最優濃度[6]相比，PTD-FNK蛋白的使用量明顯減少。

細胞凋亡是一個復雜的過程，包括誘導、執行及降解3個主要步驟，質膜磷脂酰絲氨酸（PS）位置的外移[11]是細胞凋亡過程中的特征性現象[12]。由圖1可知，通過流式細胞儀檢測PS與Annexin-V的結合以及PI檢測，添加10 nmol/L PTD-FNK蛋白使豬凍融精子的凋亡比率顯著降低，說明其在該濃度下可抑制凍融豬精子的凋亡，該結果與表觀質量結果相吻合。研究表明，由線粒體介導的內源性凋亡途徑中[13]，Bax可以促進mPTP的開放而促進凋亡[14]。由圖2中的mRNA表達量可知，添加10 nmol/L PTD-FNK蛋白對線粒體通路相關基因Bax和caspase-9有明顯的下調作用。下游基因凋亡執行者caspase-3是細胞凋亡的關鍵之一，它的激活標志著細胞凋亡進入不可逆的進程[15]。

由上述幾個結果推測，10 nmol/L是PTD-FNK的最優濃度，能夠有效地抑制凍融豬精子凋亡，同時提示其保護作用可能與線粒體內源性途徑有關。細胞凋亡是影響凍后精子質量的主要因素，它顯著影響凍后精子的活力，caspase高活性表達的精子預示其對抗低溫環境的能力也較弱[16]，結合前面的研究，選取最優濃度10 nmol/L為研究濃度，以及caspase系列3個通路代表檢測其蛋白酶活性。同時，有研究表明冷凍損傷造成的凋亡不涉及非caspase蛋白酶為依賴途徑，而是由線粒體途徑介導[17]。由圖3可知，線粒體的代表蛋白酶caspase-9也發生明顯下調。值得注意的是，caspase-8不管在蛋白酶活性或者基因表達量上均與對照組無顯著性差異，這與Shimokawa等的研究[6]是一致的。在內質網凋亡途徑中caspase-12起著至關重要的作用[14，18]，本研究對內質網途徑相關蛋白酶caspase-12活性的檢測，與對照組無顯著差異，結合mRNA表達結果可推測PTD-FNK對凍融精子的抗凋亡作用有可能是通過阻礙線粒體凋亡途徑，而不通過死亡受體途徑以及內質網途徑。在誘導凋亡過程發生后，隨著線粒體孔道的開放，線粒體膜電位發生下降及細胞色素C釋放至胞漿，細胞色素在細胞凋亡執行過程中位于樞紐作用[19]，于是試驗又進一步驗證了線粒體膜孔道的開放性，結果顯示，試驗組與對照組相比，mPTP的開放程度顯著性降低，進一步推測PTD-FNK有可能是通過阻礙線粒體膜孔道的開放，進而抑制線粒體途徑誘導凋亡，起到保護凍融精子的作用。

綜上所述，PTD-FNK蛋白對凍融豬精子具有保護作用，且10 nmol/L時的保護效果最佳，而其作用機制有可能是通過抑制線粒體與mPTP相關BH3-only中Bax的表達進而抑制mPTP的開放，進一步抑制相關caspase的活性，阻礙了線粒體內源性途徑的凋亡，從而起到保護凍融精子的作用。其中，具體的通路交聯方式需要更深一步的研究來說明。本試驗為深入研究PTD-FNK蛋白抑制凍融精子凋亡的機制并促進其實際應用奠定了基礎。

4 結論

研究結果表明，PTD-FNK蛋白可能是通過抑制內源性線粒體途徑介導的凋亡發揮對精子冷凍解凍的保護作用。

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