卵母細胞滑面內質網聚集體對臨床結局和早期出生結局的影響

王雪，肖亞玲，孫正怡，甄璟然，郁琦，鄧成艷，周遠征，王含必

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦科內分泌與生殖中心，北京 100730)

在輔助生殖技術中，患者的妊娠結局取決于胚胎的質量好壞，而胚胎發育潛能與卵母細胞質量息息相關，因此對卵母細胞形態和發育潛能進行正確評估非常重要。通常卵母細胞的評估方法是基于胞漿外和胞漿內的一些特征進行的，包括極體形態、卵周間隙、折射體、胞內顆粒、空泡和滑面內質網等[1]。在正常卵母細胞中滑面內質網呈多個、分散的球形聚集模式，周圍由線粒體包繞[2]。而卵母細胞內滑面內質網聚集(Smooth endoplasmic reticulum clusters，sERC)是卵母細胞胞漿內的一種異常滑面內質網聚集體，以單個大聚集體模式聚集[3]，表現為圓形、 扁平且清晰的盤狀物，直徑約為10～18 mm[4]。目前國內外學者已對sERC做了很多相關研究，但在輔助生殖過程中是否可以移植含sERC的卵母細胞發育而來的胚胎還無明確結論。

盡管2011年的歐洲人類生殖與胚胎學學會(Alpha/ESHRE)專家共識建議丟棄含sERC的卵母細胞[1]，但是各個中心對含有sERC的卵母細胞的處理仍然缺乏統一的認識。最近歐洲一項多中心的調查顯示，48%(56/118)的中心受Alpha/ESHRE共識的影響，改變了對含sERC卵母細胞的態度，但是僅僅有14%的中心在ICSI之前丟棄含sERC的卵母細胞，43%的中心并沒有丟棄含SERC的卵母細胞，但是也沒有登記和隨訪新生兒數據[5]。因此，當受sERC影響的卵母細胞沒有丟棄時，記錄胚胎的發育情況和對新生兒隨訪，并將這些數據進行發表是非常重要的。只有通過分析這些數據才能更好地明確卵母細胞的這些形態學異常是否與文獻中記錄的先天異常有關。因此，本中心進行了此前瞻性的觀察性研究，對近2年出現含sERC卵母細胞的胚胎發育情況及臨床和新生兒結局進行統計分析，追蹤含sERC卵母細胞的移植預后，試圖為含sERC卵母細胞的可用性問題增添新的證據。

資料與方法

一、研究對象與分組

收集2016年12月至2018年8月在我院生殖中心進行ICSI助孕治療的患者納入研究。按照本中心的常規操作，無額外操作，所有患者均簽署知情同意書。本研究納入標準為：(1)進行ICSI操作的患者；(2)新鮮取卵周期。排除標準為：(1)進行常規IVF的患者；(2)男方為睪丸穿刺取精或副睪穿刺取精的患者；(3)進行植入前遺傳學診斷或篩查的患者。

根據患者獲卵時卵母細胞中是否出現sERC，分為sERC+周期組(A組)和sERC-周期組(B組)，A組即該周期每個人所獲得的卵母細胞中至少出現1個sERC卵母細胞，共80個周期，B組即所獲得的卵母細胞中均未出現sERC，共1 492個周期。A組中再根據卵母細胞是否出現sERC，進一步分為sERC+卵母細胞組(A1組，共140個)和sERC-卵母細胞組(A2組，共416個)。再根據所移植的胚胎是否來源于sERC卵母細胞，分為Ⅰ組：所移植胚胎全部來源于sERC+卵母細胞；Ⅱ組：所移植胚胎中的1枚胚胎來源于sERC+卵母細胞，1枚來源于sERC-卵母細胞；Ⅲ組：所移植胚胎均來源于sERC-卵母細胞。

二、研究方法

1.控制性促排卵和取卵：所有患者的促排方案按照本中心的常規進行，主要是GnRH激動劑長方案和GnRH拮抗劑方案，使用卵泡刺激素(FSH，果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)進行卵巢刺激。當主導卵泡直徑達到18～20 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)，38 h后進行陰道超聲引導的卵泡穿刺來獲取卵母細胞。

2.卵母細胞sERC的評估及ICSI操作：獲取卵母細胞后2 h左右用透明質酸酶消化顆粒細胞，拆除卵母細胞周圍顆粒細胞，放置培養箱培養2 h左右進行ICSI操作。ICSI時，在倒置顯微鏡下評估每一個卵母細胞的形態，并記錄相關數據。在高倍鏡下，胞漿內大的sERC表現為圓形、扁平且清晰的盤狀物，與空泡相似，但sERC內無液體，折光性相對較弱，兩者易于鑒別[6-7]。在ICSI操作時應盡量避免將精子注射到sERC內。

3.胚胎培養、評估和臨床判斷：ICSI后18～20 h觀察原核情況，若出現2個原核(2PN)判斷為正常受精。取卵后第3日進行胚胎的形態學評估，根據卵裂球的數目、大小、形態及碎片的狀態進行評分，挑選質量最好的兩枚胚胎進行移植，如不能移植則將兩枚胚胎進行冷凍保存，其余所有胚胎均進行囊胚培養，在取卵后第5日或6日觀察囊胚形成情況，并根據Gardner評分法[8]進行評分，挑選內細胞團質量達到A或B級的囊胚進行冷凍，C級的囊胚放棄，滋養細胞層的質量不限。冷凍操作方法按照本中心的常規進行。移植后25～30 d超聲檢查，可見胎囊并有胎心搏動者判斷為臨床妊娠.

4.觀察指標：胚胎相關的測量指標包括：(1)受精率=受精數/MⅡ卵母細胞數×100%；(2)優質胚胎率=優質胚胎數/卵裂數×100%；(3)囊胚形成率=囊胚數/(卵裂數-移植數-卵裂期冷凍數)×100%；(4)種植率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%。臨床相關的測量指標包括：(1)臨床妊娠率=臨床妊娠例數/移植周期數×100%；(2)流產率=流產例數/臨床妊娠例數×100%。(3)活產率=隨訪獲得活產的總例數/移植周期數×100%。新生兒的數據包括：孕周、出生體重、體長、性別、出生時的畸形情況。

三、統計方法

結 果

本研究共納入1 435例患者，共1 572個ICSI周期，其中出現sERC的周期為80個周期，即sERC+周期組(A組)；sERC-周期組(B組)為1 492個周期。至少出現1個sERC卵母細胞的周期發生率為5.1%。總共納入分析的MⅡ卵母細胞為6 759個，其中存在sERC的卵母細胞為140個，發生率為2.1%。A組中，sERC卵母細胞的發生率為34.6%。

一、A、B兩組一般情況比較

兩組的年齡、不孕年限和Gn用量比較均無顯著性差異(P>0.05)。A組HCG日E2水平略高于B組，但尚無顯著性差異(P>0.05)；兩組的促排卵方案比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、A、B兩組的胚胎發育指標和臨床情況比較

A組獲卵數、成熟卵率和受精率略高于B組，但均無顯著性差異(P>0.05)；A組的囊胚形成率顯著低于B組(P<0.05)；兩組的種植率、臨床妊娠率、流產率和活產率比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、A、B兩組的新生兒結局的比較

由于2018年移植的患者尚有部分未分娩，所以分娩結局只分析至2018年5月底的數據。A組的新生兒出生體重略低于B組，且A組的早產率略高于B組，但兩者比較均無顯著性差異(P>0.05)；兩組的出生缺陷率比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

組 別周期數年齡不孕年限Gn用量(支)基礎LH(U/L)A組8035.2±3.94.6±3.135.4±4.14.1±3.0B組1 49235.4±4.34.7±3.034.5±11.74.2±2.7組 別周期數HCG日激素水平促排卵方案E2(pmol/L)P(nmol/L)LH(U/L)GnRH激動劑GnRH拮抗劑A組803 876.4±1 298.63.5±1.32.2±1.160(75.0)20(25.0)B組1 4923 256.5±1 356.83.8±1.62.3±0.91 089(73.0)403(27.0)

組 別周期數獲卵數成熟卵率受精率優胚率A組807.8±3.888.1(556/631)91.0(506/556)12.3(62/505)B組1 4927.2±4.786.2(9 289/10 776)89.4(8 306/9 289)9.7(807/8 283)組 別周期數囊胚形成率種植率臨床妊娠率流產率活產率A組8028.7(104/363)*23.3(28/120)35.9(23/64)10.5(2/19)28.5(16/56)B組1 49233.7(1 968/5 838)26.1(574/2 201)39.6(468/1 181)22.0(91/414)29.9(312/1 045)

注：與B組比較，*P<0.05；獲卵數、成熟卵率、受精率、優胚率、囊胚形成率、種植率和臨床妊娠率按照總移植人數計算(2016～2018年)；由于2018年移植的患者目前尚有部分未分娩，故流產率和出生率按照截至2018年5月底前移植的人數計算

組 別分娩周期數性別比(男/女)出生體重(g)雙胎率出生缺陷率早產率A組160.67(8/12)2 706.0±551.525.0(4/16)025.0(4/16)B組3131.05(192/183)2 942.0±628.519.8(62/313)0.6(2/313)16.9(53/313)

四、A組中A1組和A2組的胚胎發育情況比較

A組80個sERC+周期中共獲得140個sERC+卵母細胞(A1組)，416個sERC-卵母細胞(A2組)。其中A1組的受精率、囊胚形成率顯著低于A2組(P<0.05)，A1組的優質胚胎率有低于A2組的趨勢，但尚無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 A1組和A2組的胚胎發育情況比較 (%)

注：與A2組比較，*P<0.05

五、新鮮移植sERC+卵母細胞的臨床結局比較

在A組中，只有2個周期全部進行兩枚sERC+卵母細胞來源的胚胎移植，有2個周期只有1枚胚胎可移植，且都是sERC+卵母細胞來源，在這4個周期(Ⅰ組)中只有1枚胚胎著床，且成功分娩。10個周期(Ⅱ組)進行sERC+/sERC-卵母細胞來源的胚胎移植，其中4例獲得臨床妊娠，已經隨訪的2例患者均已分娩。50個周期(Ⅲ組)進行sERC-卵母細胞來源的胚胎移植，其中18例獲得臨床妊娠。3組的種植率和臨床妊娠率比較無顯著性差異(P均>0.05)，3組均未出生畸形兒(表5)。

表5 不同sERC+、sERC-卵母細胞來源胚胎的臨床結局(%)

注：移植周期數、種植率、臨床妊娠率按照總移植人數計算(2016～2018年)；由于2018年移植的患者目前尚有部分未分娩，故出生率和畸形率按照截至2018年5月底前移植的人數計算

討 論

既往文獻報道在促排卵周期中，sERC的發生率為5.4%～23.1%不等[9-10]。在本研究中，至少出現一個sERC卵母細胞的周期發生率為5.1%。sERC的觀察取決于觀察者的經驗水平和所應用顯微鏡，可以在光學顯微鏡下觀察到一些直徑較大的sERC，而一些較小的sERC卻不容易被發現。迄今為止sERC的形成原因尚不清楚，有研究顯示sERC的形成可能是由于卵巢過度刺激造成的，認為HCG日E2水平與sERC的形成有顯著相關性[6]。在本研究中我們發現盡管A組獲得的卵母細胞數略高于B組，HCG日E2水平略高于B組，但組間比較均無顯著性差異。另有研究發現在培養過程中sERC體積會增大，認為所有sERC之間或小sERC之間存在連接，其可以在卵母細胞中形成較大的sERC；以及提前出現的LH峰會引起MⅡ卵母細胞出現sERC，認為sERC是卵巢促排卵過程中激發LH之前胞漿過度成熟的標志，其可能是胞漿過熟的一個表現[10]。

關于sERC對胚胎發育影響的爭議較大。在本研究中，我們發現A組與B組的受精率和優胚率相似，組間比較無顯著性差異，這與之前一些研究結論[9，11-13]相似。但也與一些研究結論相反，有學者認為在正常生理情況下，滑面內質網會釋放鈣離子，其在卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發育階段發揮關鍵作用，而sERC的異常分布類型可能會參與鈣離子信號的異常調節，導致sERC+周期組的受精率顯著下降[14-16]。在本研究中我們還發現A組的囊胚形成率顯著降低，這與Ebner等[17]的研究結論一致。我們根據A組內卵母細胞是否存在sERC進行分組，并對兩亞組進行比較，發現A1組的受精率顯著低于A2組，將胚胎培養至Day5～6時，A1組的囊胚形成率顯著低于A2組，這與之前一些研究結論[6，11]相似。盡管在受精后第3天胚胎的發育速率與正常卵母細胞相比并無顯著性差異，但sERC+卵母細胞的囊胚發育更慢一些，而且有研究顯示囊胚的擴張程度和孵化狀態都受sERC的影響，sERC+卵母細胞來源的囊胚的內細胞團(Inner cell mass，ICM)質量更差一些，sERC能夠使ICM質量下降35%[18]。最近Otsuki等[10]進行了一項Time-lapse的研究，記錄并比較了sERC+卵母細胞的分裂過程，他們發現sERC+組卵母細胞的有絲分裂或減數分裂錯誤率顯著高于非sERC卵母細胞。如果在有絲分裂或減數分裂期間發生卵裂失敗就會導致胚胎染色體異常。一旦卵裂失敗的細胞發育為滋養細胞，就會出現胎盤異常；如果這些細胞發育為ICM，會導致進一步的卵裂失敗，反過來會引起非整倍體。總之，從這些結論中我們很難總結sERC是否會影響Day3的胚胎質量，而且囊胚形成率低的原因還不是很清楚，還有待于進一步研究。

在本研究中，我們發現A組與B組的種植率、臨床妊娠率相似，組間比較無顯著性差異，這與Hattori 等[12]的研究結論相似。由于2018年移植的患者中還有部分沒有分娩，因此在統計妊娠結局時我們只統計至2018年5月底，在有分娩結局的患者中，我們發現A組的出生體重略低和早產率略高，分析原因可能是因為A組雙胎較多造成的，與sERC本身的關系可能不大。我們還分析了A組內，單純移植sERC+卵母細胞、移植sERC+/sERC-和完全sERC-卵母細胞的出生結局。在日常工作中，由于考慮到sERC對胚胎及出生結局的影響尚不確切，我們會優先移植非sERC卵母細胞來源的胚胎，因此移植sERC卵母細胞來源胚胎的周期數較少，僅有4個周期完全移植sERC來源的胚胎，有1例活產，胎兒未見異常。10個周期移植了至少1枚sERC+卵母細胞來源的胚胎，在隨訪的4個妊娠周期中有2例分娩，胎兒未見異常，這與Mateizel等[9]的研究結論相一致，他們發現移植來源于顯著sERC卵母細胞的胚胎后可以生育正常無畸形的孩子；該研究納入了394個sERC+周期，81例活產，sERC+卵組與sERC-組的新生兒畸形率無顯著差異。同樣Itoi等[13]也未發現移植sERC+卵母細胞來源的囊胚后，新生兒的結局與sERC-組有統計學差異。盡管本研究的數據有限，但也支持這樣的結論，因為在這些來源于sERC+卵母細胞出生的孩子中，并沒有發現異常。既往有一些研究提示sERC可能與較差的臨床結局和新生兒結局相關：Otsuki等[6]的研究顯示sERC+周期組的臨床妊娠率降低，而生化妊娠率升高；Ebner等[17]認為移植sERC卵母細胞來源的胚胎更容易發生早產和低出生體重；還有研究發現移植sERC卵母細胞來源的胚胎后發生新生兒先天異常的比例增加，如Beckwith-Wiedmann綜合征、心血管畸形和多發畸形的發生率大大增加[6，16，19]；最近還有文獻報道了1個來源于sERC+卵母細胞的復雜的染色體異常[20]。但是復習文獻，我們知道與自然周期相比，ART操作后出生的孩子更容易發生印記缺陷[21]，所以很難判斷印記缺陷是否是由sERC造成。而且不同研究間的差異也可能是由于設計方案、樣本量大小、卵巢刺激方案、人群變異或其他因素的不同而造成。就本研究而言，移植sERC卵母細胞來源的胚胎后可以出生正常孩子，但也存在一些疑慮，即出生時正常能否代表將來的發育正常。因此，對sERC卵母細胞來源的孩子還需要進行長期隨訪，關注發育過程是否有異常。

總之，在輔助生殖過程中，sERC+卵母細胞的安全性問題還有待于進一步商榷，對于獲卵數少的患者，如果采納Alpha共識，完全丟棄sERC+卵母細胞，那么患者的周期取消率會顯著增加。因此，對于胚胎數量少和僅有sERC+卵母細胞來源胚胎的患者來講，在充分知情同意的前提下，可以考慮移植sERC+卵母細胞來源的胚胎。在將來，sERC形成的分子機制以及sERC對卵母細胞和胚胎的影響還有待于進一步研究，對sERC卵母細胞來源的新生兒的安全性還需要進行多中心的長期隨訪研究。