尼達尼布對百草枯致老年小鼠肺纖維化的保護作用及機制

呂驍 張宏英 翁恒 毛雅云 林旭

(福建醫科大學教學醫院福建省福州肺科醫院，福建 福州 350000)

百草枯(PQ)能夠造成肺泡上皮的氧化損傷從而導致呼吸衰竭，隨后發生纖維化，是導致患者致死的主要原因〔1〕。然而目前PQ沒有真正的藥理學拮抗劑，也沒有能夠結合血液或其他組織中毒物的螯合劑〔2〕。尼達尼布(NIB)作為一種抑制劑能夠靶向作用于多種酪氨酸激酶〔3〕，可以改善特發性肺纖維化患者肺部纖維化程度，但是對于PQ誘導的老年小鼠肺纖維化目前尚無報道。本研究探討NIB對于PQ誘導的老年小鼠肺纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蛋白激酶B(AKT)，細胞外調節蛋白激酶(ERK)，血小板衍生的生長因子受體(PDGFR)抗體購于cell signaling technology 公司。NIB購于MCE公司。HE和Masson染色試劑盒由北京海德創業公司提供。白細胞介素(IL)-1β，腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒購自上海藍基生物公司；丙二醛(MDA)及髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒購自上海翔升生物公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及實驗分組 20～24周齡，體重30～35 g C57BL/6老年雄性小鼠36只，由北京華孚康生物科技實驗動物中心提供，隨機分為假手術(Sham)組，PQ組、PQ+NIB組，每組12只。通過給予小鼠PQ 20 mg/kg灌胃來建立肺纖維化模型，Sham組則給予等量生理鹽水，連續給藥3 d，之后PQ+NIB組給予NIB 60 mg/kg灌胃干預。在干預7 d后每組小鼠取血后處死，收集肺組織。

1.2.2 檢測方法 (1) 應用酶聯免疫吸附試驗檢測小鼠血清TNF-α、IL-1β水平，肺臟組織MDA、MPO水平。(2)留取肺組織，應用二喹啉甲酸(BCA)蛋法提取肺組織蛋白。

1.2.3 Western印跡法檢測PDGFRα、PDGFRβ、磷酸化(p)-PDGFRαβ、p-AKT、p-ERK的表達水平 將提取后的蛋白進行上樣，電泳，轉膜，封閉，洗膜，一抗4℃過夜孵育，用洗膜液漂洗后，二抗雜交1 h，清洗后加上電化學發光劑(ECL)顯色，上機檢測。

1.2.4 肺組織病理形態學觀察 取肺組織，常規沖洗后多聚甲醛固定，石蠟包埋切片并經蘇木素-伊紅(HE)和馬松(Masson)染色法顯微鏡下觀察各組肺部的炎癥浸潤及纖維化情況。

1.2.5 細胞凋亡實驗 采用Tunel試劑盒進行染色，顯微鏡下可觀察到深棕色細胞核，此為凋亡細胞。根據以下公式進行凋亡率的計算：凋亡率(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%，每個樣本隨機計數5個視野，取均值。

1.3 統計學分析 使用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 各組血清TNF-α、IL-1β水平及肺臟組織、MDA、MPO水平比較 與Sham組比較，PQ組血清TNF-α、IL-1β水平及肺組織MDA、MPO水平均顯著升高(P<0.05)，提示造模成功。PQ+NIB組上述各項指標的升高程度均較PQ組明顯緩解(P<0.05)。見表1。

表1 各組TNF-α、IL-1β、MDA、MPO表達水平比較

與Sham組比較:1)P<0.05；與PQ組比較:2)P<0.05;同下表

2.2 肺組織病理學觀察 與Sham組相比，HE染色下PQ組小鼠肺組織水腫，中性粒細胞大量浸潤，肺泡壁增厚。Masson染色顯示PQ組小鼠肺組織纖維化明顯增加，PQ+NIB組肺臟病理改變明顯緩解。見圖1。

2.3 肺組織Tunel染色 較Sham組〔(3.1±0.42)%〕相比，PQ組小鼠肺組織中Tunel陽性細胞顯著增加〔(39.2±4.67)%，P<0.05〕，與PQ組比較，PQ+NIB組肺臟Tunel陽性細胞的增加程度明顯緩解〔(15.6±1.22)%,P<0.05〕。見圖2。

2.4 Western印跡檢肺組織PDGFRα、PDGFRβ、P-PDGFRαβ、P-AKT、P-ERK蛋白表達 與Sham組比較，PQ組p-PDGFRαβ、p-AKT、p-ERK蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，PQ+NIB組上述蛋白水平明顯低于PQ組(P<0.05)。見圖3、表2。

圖1 各組炎癥浸潤及纖維化情況(×400)

圖2 各組Tunel染色情況(×400)

圖3 Western印跡檢測PDGFRα、PDGFRβ、p-PDGFRαβ、p-AKT、p-ERK蛋白表達

組別 p-PDGFp-AKTp-ERKSham組1.00±0.081.0±0.141.0±0.12PQ組4.12±0.341)2.2±0.191)1.9±0.191)PQ+NIB組1.32±0.112)1.42±0.062)1.3±0.082)

3 討 論

PQ被攝入后可造成體內多臟器功能損害〔4〕。PQ能夠在肺組織中高濃度蓄積，以肺纖維化和神經損害表現最常見〔5〕。急性肺泡炎，大量炎癥細胞浸潤，肺部水腫，肺泡壁增厚為PQ中毒后早期的肺部表現；中晚期則表現為肺間質內大量纖維化生成〔6〕。PQ造成的肺損傷的主要機制包括：(1)PQ抑制抗氧化酶的生成與活性，導致自由基生成及脂質過氧化增多，從而加重氧自由基對肺組織的損傷；(2)PQ能夠促進大量的炎癥細胞增殖、浸潤，炎癥細胞分泌大量的炎癥因子破壞肺泡上皮細胞，成纖維細胞大量激活，肺間質內纖維化增加；(3)氧自由基大量生成及DNA損傷誘導細胞凋亡，從而影響肺功能〔7〕。NIB靶向作用于靶向成纖維細胞生長因子(FGFR)1、2、3，PDGFRα和PDGFRβ及血管內皮生長因子受體(VEGFR)1、2、3受體，目前主要用于治療特發性肺纖維化〔2〕。研究表明NIB具有抗凋亡〔8〕、抑制炎癥〔9〕、抗增殖，抗纖維化〔10〕等生物學作用。本實驗通過HE染色結果顯示NIB通過減少炎癥細胞的浸潤發揮一定的抗炎作用，同時肺中炎癥因子IL-1β和TNF-α濃度降低，減輕了炎癥反應。 有報道〔11〕PQ造成小鼠炎癥細胞浸潤增加，并且基質金屬蛋白酶(MMP)-2表達升高；同時炎癥能導致蛋白酶大量釋放與肺基質破壞、肺纖維化關系密切。因此抑制炎癥能夠減輕PQ導致的肺損傷。而在肺間質纖維化的過程中，PDGFRα和PDGFRβ的激活及自身磷酸化能夠導致成纖維細胞的增殖和表型轉化，促進肺纖維化的發生發展。本實驗發現NIB能夠抑制PDGFR磷酸化，并影響下游信號通路AKT及ERK的磷酸化來發揮抗凋亡和抗纖維化的作用，從而保護PQ導致的肺損傷。綜上所述，NIB可以通過抑制炎癥細胞的浸潤，炎癥因子的產生，抗細胞凋亡，抑制PDGFR/AKT/ERK信號通路抗纖維化等多個途徑改善PQ對老年小鼠肺蛀損傷作用，減輕肺纖維化，減輕肺組織損傷，改善小鼠預后。