狼毒大戟總提取物對乳腺癌細胞增殖及周期的影響

李美男

【摘要】目的：觀察狼毒總提取物對乳腺癌細胞增殖及周期影響。方法：CCK-8法測定該藥對MCF-7、MDA-MB-231、SK-Br-3細胞株增殖影響，流式細胞術檢測狼毒總提取物對MCF-7細胞周期影響。結果：狼毒總提取物對細胞IC50濃度分別為227ug/ml、793ug/ml、1034ug/ml。藥物作用隨著藥物濃度提高。MCF-7周期檢測，G0/G1期期比例下降、S期比例上升。結論：狼毒提取物對MCF-7、MDA-MB-231、SK-Br-3細胞生長均有抑制作用。主要研究了MCF-7細胞抑制機制，提示狼毒大戟總提取物抑制MCF-7細胞G₂/M期到G。/G₁其轉換。

【關鍵詞】狼毒大戟;乳腺癌;細胞增殖

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率增長逐漸呈現年輕化趨勢，預計2021年，中國乳腺癌發病率將位居腫瘤發病率的第二位，乳腺癌患者將高達250萬，嚴重威脅女性的身體健康。乳腺癌的發生跟人體內激素水平、遺傳因素、飲食習慣、生殖因素等有關，占女性新發癌癥總數約25%，死亡率高，嚴重威脅了廣大女性的生命和健康。目前乳腺癌的西醫治療以手術治療、內分泌治療、放射治療、分子靶向治療等為主要治療手段。但多數患者仍出現復發轉移、耐藥及放化療給患者帶來的不同程度毒副作用，因此利用中藥進行綜合調節治療也是近年來研究的熱點領域。中藥治療能夠有效地減輕患者的臨床癥狀，提高他們的生存質量，并防止腫瘤細胞的復發轉移，同時還可以與放化療配合增效減毒。因此從天然產物中尋找抗腫瘤化合物己經成為抗腫瘤藥物研發的重要方向。

狼毒大戟首記載于《神農本草經》，一般取其根部入藥，味辛、性平、有毒，入肺、肝經，有逐水祛痰，散結殺蟲的功效。《本經》中就有：“狼毒破積聚，治惡瘡，消盎毒”的論述。狼毒大戟含有多種黃酮類、二萜類、倍半萜類、香豆素類、木脂素類及苯丙素苷類等化學成分，現代藥理研究學表明，狼毒的水提液、醇提液或者不同種的炮制品均表現出一定的抗腫瘤活性。本實驗主要探討狼毒大戟對體外培養的不同類型的乳腺癌細胞的增殖影響。

1材料

1.1試劑與藥品

狼毒大戟總提取物由沈陽藥科大學藥學院提供。

1.1.1試劑

1640培養液、DMEM培養液購于Hyclone公司;胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、PBS購于Genvew公司;胎牛血清購于Clark公司;CCK-8試劑購于Vazyme公司;碘化丙錠溶液購于北京鼎國盛生物技術有限公司。

1.1.2瘤株

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231（三陰型）、MCF-7（luminal A型）、SK-BR-3（HER2陽性型）均購于中科院上海細胞庫。

1.2儀器

Thermo Scientific生物安全柜（購于美國公司Thermo Fisher Scientific公司）;二氧化碳培養箱（美國Thermo FisherScientific公司）;Olympus CKX31倒置顯微鏡（上海賴式電子科技有限公司）;ACCergraX-15R臺式冷凍離心機（美國Beckman coulter公司）;Mettler Toledo型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;FLUOstar Omega型多功能酶標儀（德國BMG公司）FACSCaulibur流式細胞儀（美國BD公司）。

2實驗方法

2.1細胞培養

LminalB型人乳腺癌細胞MCF-7采用10%胎牛血清的1640培養基、三陰型人乳腺癌細胞MDA-MB-231、Her-2陽型人乳腺癌SK-Br-2細胞采用15%胎牛血清的DMEM高糖培養基于5%C0₂，37℃培養箱培養，每2-3天傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2CCK-8

2.2.1收集細胞

將長至80%細胞消化離心，加入全培養液，細胞計數，每lOOul約6×10³個細胞，加細胞懸液100ul到96孔板（邊緣孔用無菌水或PBS填充），設置空白組（無細胞）和對照孔（培養基不加藥，有細胞）。置37℃，5%CO₂孵箱孵育過夜。

2.2.2加藥

取出96孔板，吸出培養液，每孔加入100uF孔狼毒總提取物，設置5個藥物濃度梯度，分別為1000ug/ml、500ug/ml、300ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、30ug/ml、10ug/ml、lug/ml、每個濃度5個復孔，于5%C0₂的培養箱內，在37℃>條件下培養24h。

2.2.3CCK-8檢測OD值

每孔加入10ul CCK-8溶液，孵箱孵育2h后檢測，450nm各孔吸光值，計算OD值公式為細胞活性%=（加藥細胞OD-空白OD/對照細胞OD-空白OD）x100%。

2.3細胞周期

2.3.1收集細胞

取對數生長期的MCF-7細胞的，以每個孔2x10⁶細胞密度接種于六孔板，孵箱孵育24h。

2.3.2加藥

每孔加入100ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的狼毒總提取物，設置陰性對照組（不加藥物不加PI染液）及空白組（不加藥物加PR染液）于5%CO₂，37℃孵育24h。

2.3.3染色流式儀檢測

將六孔板中細胞消化離心，用預冷PBS沖洗一遍，加入75%乙醇輕輕吹勻細胞，4℃過夜。3000轉10min離心，收集細胞，用預冷PBS吹洗1遍，加入碘化丙錠（PI染液）冰上孵育30min，PBS沖洗一遍，上機檢測。計算細胞周期。

3結果

3.1不同濃度藥物對乳腺癌細胞增殖的影響

不同濃度狼毒總提取物作用于乳腺癌細胞24h后，MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3，細胞增殖均有不同程度影響，其IC50分別為227ug/ml、793ug/ml、720ug/m1。對各種細胞系敏感程度排序為MCF-7>MDA-MB-23I>SK-BR-3。結果見表1、圖1。

3.2狼毒大戟對MCF-7增殖周期影響

不同藥物濃度作用后，低、中、高藥物濃度和陰性對照組G₁期細胞所占比分別為：68.92%、66.71%、64.6%、57.22%;G2期分別為12.65%、15.33%、19.1%、30.32%。結果見圖2。結果表明，隨之狼毒大戟總提取物濃度的增加，G₀/G₁其比例逐漸下降，G₂期上升，提示狼毒大戟總提取物抑制MCF-7細胞GJM期到G₀/G₁。其轉換。

4結論

狼毒大戟是大戟科狼毒屬植物，俗稱貓眼草，中醫記載其主要用于治療水腫腹脹、結核、蟲積疥瘡、積聚等疾病?，F代藥理學研究發現，其具有抗菌、抗病毒、調節免疫力、抗腫瘤等作用。近幾年來對狼毒大戟提取物抗腫瘤的報道越來越多，狼毒大戟中主要有二萜類、黃酮類、香豆素類化合物、木脂體類等化學成分，楊瑾等研究表明，狼毒大戟提取物可以影響人肝癌細胞上皮間質化。孟明靜等研究表明狼毒水煎液可抑制A549細胞生長，并對其遷徙也有一定影響。在臨床上，狼毒大戟干品制成的注射液，對肺癌、乳腺癌均有一定療效、楊德全用狼毒二鱉消積湯治療原發性肝癌3個月。結果表明：顯效9例，有效11例，無效5例，總有效率達80%。

由于狼毒大戟為中藥制劑，其成分復雜，本實驗選用了狼毒大戟總提取物為研究對象，試探討狼毒總提取物對乳腺癌的作用機制，CCK-8結果表明，狼毒總提取物對乳腺癌細胞的增殖有抑制作用，針對三種類型乳腺癌細胞，MCF-7對狼毒總提取物最為敏感，周期結果表明，狼毒總提取物作用于培養的MCF-7人乳腺癌細胞24h，使細胞周期阻止在G2/M期，本研究初步證明了狼毒大戟總提取物具有抗乳腺癌細胞的活性，并且是通過阻止細胞周期來影響細胞的增殖，但其具體機制還需進一步研究。