油茶蒲不同溶劑粗提液的總黃酮提取率與抗氧化活性比較

吳蘇喜,吳美芳 ,謝妍祎,周青青,譚傳波, 張謙益

(1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，長沙 410114； 2.湖南大三湘茶油股份有限公司，湖南 衡陽 421141；3.道道全糧油股份有限公司，湖南 岳陽 414000)

油茶(Camelliaoleifera)是我國特有的茶科山茶屬多年生木本油料植物，從油茶果中榨取的油茶籽油營養(yǎng)豐富，富含油酸，被譽(yù)為“東方橄欖油”[1]。油茶蒲是油茶果的外皮，也叫油茶果殼，占油茶鮮果質(zhì)量的 60%～70%，是油茶加工的重要副產(chǎn)物，年產(chǎn)量達(dá)200萬t[2]。目前，油茶蒲利用效率極低[3]，除少量用作有機(jī)肥料、活性炭生產(chǎn)原料以及食用菌栽培原料以外，大多數(shù)被廢棄或焚燒，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。因此，探索油茶蒲的高效利用途徑，已成為油茶產(chǎn)業(yè)急需解決的熱點(diǎn)問題，并具有重要應(yīng)用價值和科學(xué)意義。

根據(jù)研究[4]報道，油茶蒲中含有黃酮、多酚、皂苷、多糖等成分，這些成分具有許多生物活性，如抗氧化活性、清除自由基活性等，可作為生物醫(yī)藥原材料。于是，人們開始研究油茶蒲中有效成分的提取。目前，提取黃酮類化合物所用溶劑主要有甲醇[5]、乙醇[6-7]，同時采用分級萃取的方式富集不同極性的黃酮類化合物，常用萃取劑包括乙酸乙酯[3]、正丁醇[8]、氯仿、水[9]、石油醚[10]。劉朝旭等[11]采用微波法提取甘草黃酮，得率為3.01%，同時甘草總黃酮具有較好的DPPH·清除能力。高進(jìn)勇等[12]采用95%乙醇提取油茶粕中黃酮類化合物，并探索了其分子組成及抗氧化活性，得出醇提黃酮類化合物清除 DPPH·半抑制濃度(IC50) 為 0.44 mg /mL。肖燕等[13]利用乙醇提取油茶枯餅的黃酮類化合物，并進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，研究表明油茶枯餅中黃酮類化合物對DPPH·具有明顯的清除效果。但目前人們對不同溶劑的黃酮提取效果及其提取物的抗氧化活性缺乏比較研究。本文采用各具5個體積分?jǐn)?shù)梯度的5種有機(jī)溶劑對油茶蒲進(jìn)行超聲輔助浸提而得到25種粗提液，測定各粗提液的黃酮提取率和清除DPPH·的能力，可為油茶蒲有效成分的提取和開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶蒲：由湖南瀏陽聚康油茶種植專業(yè)合作社提供的2017年油茶鮮果經(jīng)陰干、裂果而得。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、1,3-丁二醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV 5200型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限責(zé)任公司；XH- 2008DE型智能溫控雙頻超聲波萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油茶蒲粉的制備

油茶蒲經(jīng)粉碎和過篩(80目)處理得到油茶蒲粉，裝瓶密封備用。

1.2.2 提取劑的配制

分別量取適量的無水乙醇、1,3-丁二醇、丙酮、甲醇、乙酸乙酯溶劑于容量瓶，用去離子水定容至刻度(乙酸乙酯用無水乙醇定容)，分別得到5種溶劑的不同體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、60%、80%、100%)提取劑。

1.2.3 油茶蒲粗提液的制備

稱取油茶蒲粉2.0 g于錐形瓶，按料液比1∶15加入提取劑，蓋上瓶塞。將錐形瓶放入超聲波萃取儀內(nèi)，在頻率40 kHz、萃取溫度60℃條件下進(jìn)行超聲輔助浸提45 min，趁熱抽濾，用相應(yīng)提取劑洗滌濾渣，再抽濾。合并濾液，用提取劑定容至100 mL，得到粗提液。

1.2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.0153 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解并定容至50 mL，得到306 μg/mL蘆丁貯備液。精確吸取蘆丁貯備液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別放入10 mL比色管中，加入50 mg/mL亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加入 10 mg/mL硝酸鋁溶液0.3 mL ，搖勻靜置6 min，加入4 mg/mL氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，用蒸餾水定容至10 mL刻度線，靜置15 min，在510 nm波長處測定其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=0.005 2C+0.006 9(R2=0.999 1)。

1.2.5 粗提液總黃酮含量的測定及其提取率計(jì)算

精確吸取油茶蒲粗提液1.0 mL置于10 mL比色管中，按照1.2.4方法加入有關(guān)試劑，測定其吸光度(Ai)，以蒸餾水做空白對照測定吸光度(A0)。根據(jù)回歸方程計(jì)算測定液中的總黃酮質(zhì)量濃度(Ci)，再根據(jù)相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算粗提液中總黃酮質(zhì)量濃度、質(zhì)量和總黃酮提取率。

粗提液中總黃酮質(zhì)量濃度=10Ci

粗提液中總黃酮質(zhì)量=100×10Ci

1.2.6 粗提液清除DPPH·的能力測定

參考董蕊等[14]的方法，用無水乙醇配制1 mmol/L DPPH溶液，置于4℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)前，用無水乙醇稀釋至0.1 mmol/L。取油茶蒲粗提液2 mL于試管中，加入0.1 mmol/L DPPH溶液2 mL，混勻后在室溫暗處避光反應(yīng)30 min。在517 nm波長處測定其吸光度，以等體積提取溶劑和無水乙醇混合液為空白調(diào)零；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。按下式計(jì)算DPPH·的清除率。

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

式中：A0為等體積無水乙醇代替供試品測得的吸光度；Ai為試樣的吸光度；Aj為等體積無水乙醇代替DPPH 測得的吸光度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用MS Excel 2010處理，進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑種類和體積分?jǐn)?shù)對油茶蒲總黃酮提取率的影響

利用各5種體積分?jǐn)?shù)的5種提取劑超聲輔助浸提油茶蒲，得到25種油茶蒲粗提液，各粗提液的總黃酮提取率見圖1。

由圖1可見，同一種提取劑的不同體積分?jǐn)?shù)對油茶蒲的總黃酮提取率有顯著影響。除了甲醇以外，基于總黃酮提取率比較的其他提取劑(乙醇、乙酸乙酯、1,3-丁二醇和丙酮)的最佳體積分?jǐn)?shù)均為60%，這與沈建福等[15]報道的提取油茶殼中總黃酮的乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為60%結(jié)果一致。甲醇溶液最佳體積分?jǐn)?shù)為80%。丙酮對于提取油茶蒲總黃酮具有顯著優(yōu)勢。基于總黃酮提取率大小順序排列的5種溶劑及其對應(yīng)的總黃酮提取率依次是60%丙酮溶液(6.28%)、 60%乙醇溶液(5.24%)、80%甲醇溶液(4.82%)、60%1,3-丁二醇溶液(4.40%)、60%乙酸乙酯-乙醇溶液(4.13%)。但是，鑒于丙酮、甲醇的毒性較大，故可選用 60%乙醇溶液作為油茶蒲總黃酮提取劑。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)的5種提取劑對油茶蒲總黃酮的提取率

2.2 提取劑種類和體積分?jǐn)?shù)對油茶蒲粗提液清除DPPH·能力的影響

采用不同種類不同體積分?jǐn)?shù)的提取劑提取的油茶蒲粗提液處理DPPH溶液，對DPPH·的清除能力見圖2。

圖2 25種油茶蒲粗提液對DPPH·的清除率

由圖2可見，油茶蒲的不同溶劑粗提液對DPPH·的清除率都在70%以上，但相互之間存在較大的差異。除60%乙酸乙酯-乙醇溶液的油茶蒲粗提液對DPPH·的清除率最高(92.69%)以外，其他4種溶劑對應(yīng)的DPPH·清除率都隨著提取劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在提取劑體積分?jǐn)?shù)達(dá)100%時的DPPH·清除率最大，其中100%乙醇溶液對應(yīng)的DPPH·清除能力(92.78%)與60%乙酸乙酯-乙醇溶液相應(yīng)能力接近，而60%乙醇溶液對應(yīng)的自由基清除率只有81.09%。基于DPPH·清除率大小順序排列的5種粗提液及其對應(yīng)的清除率依次是100%乙醇溶液提取物(92.78%)、60%乙酸乙酯-乙醇溶液提取物(92.69%)、100%1,3-丁二醇溶液提取物(89.68%)、100%甲醇溶液提取物(86.54%)、100%丙酮溶液提取物(81.99%)。

2.3 最優(yōu)提取劑種類和體積分?jǐn)?shù)的確定

由圖2可見，極性溶劑粗提液對DPPH·的清除率隨著提取劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在提取劑體積分?jǐn)?shù)達(dá)100%時DPPH·清除率最大。以乙醇粗提液為例，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物的DPPH·清除率基本呈線性增加，100%乙醇溶液提取物的DPPH·清除率達(dá)到92.78%，遠(yuǎn)大于60%乙醇溶液提取物的DPPH·清除率81.09%。這與2.1中所述不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的總黃酮提取率呈現(xiàn)不一致趨勢，其原因可能是：乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)大于60%以后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，所提取出來的活性物質(zhì)除了黃酮以外還有其他物質(zhì)，如多糖、多酚、皂素等，而這些物質(zhì)具有DPPH·清除活性。張金磊等[16]用90%乙醇溶液提取麻瘋樹果殼多糖，得率為5.75%，同時得出乙醇體積分?jǐn)?shù)增大則多糖得率增加的結(jié)論；王銳等[17]研究了貓爪草的多酚提取工藝，最佳乙醇提取體積分?jǐn)?shù)為75%，其多酚浸出量為251.4 μg/g；李柏榆等[18]采用超聲輔助提取桑葚多酚，得出其最佳乙醇提取體積分?jǐn)?shù)為70%，總酚提取率為4.014%；李小然等[19]采用微波輔助堿性70%乙醇提取茶葉籽中茶皂素，可以顯著提高茶皂素得率，得率為21.64%。這些研究表明了溶出多糖、多酚、皂素等抗氧化活性成分的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%。但是，這些黃酮以外活性物質(zhì)的存在顯然會增大粗提液的后續(xù)純化難度。

由圖2可見，弱極性溶劑(乙酸乙酯)粗提液對DPPH·的清除率隨著提取劑體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定再減少的趨勢，在體積分?jǐn)?shù)60%時對應(yīng)的DPPH·清除率達(dá)最大值(92.69%)，這與2.1中所述乙酸乙酯-乙醇溶液的總黃酮提取率變化趨勢基本相似。

由圖1還可見，60%乙酸乙酯-乙醇溶液對應(yīng)的總黃酮提取率(4.13%)只略小于40%乙醇溶液對應(yīng)的黃酮提取率(4.24%)，但遠(yuǎn)大于100%乙醇溶液對應(yīng)的總黃酮提取率(2.84%)，60%乙酸乙酯-乙醇溶液對應(yīng)的DPPH·清除率(92.69%)卻非常接近100%乙醇溶液對應(yīng)的DPPH·清除率(92.78%)。綜合考慮2.1和2.2的研究結(jié)果，采用60%乙酸乙酯-乙醇溶液作為提取劑，所得粗提液不僅對DPPH·的清除率可達(dá)92%以上，還可以使粗提液中的活性成分相對單純，便于后期精制純化。同時，圖2顯示，40%乙酸乙酯-乙醇溶液、80%乙酸乙酯-乙醇溶液與60%乙酸乙酯-乙醇溶液所對應(yīng)的DPPH·的清除率相差不大，這也比較適合工業(yè)化生產(chǎn)容易發(fā)生乙酸乙酯濃度波動的實(shí)際需要。因此，采用60%乙酸乙酯-乙醇溶液作為提取劑制取油茶蒲粗提液，是一種比較理想的選擇。

3 結(jié) 論

(1)綜合考慮總黃酮提取率和DPPH·清除率以及工業(yè)化應(yīng)用的可行性，適合油茶蒲有效利用的最佳提取劑是60%乙酸乙酯-乙醇溶液，總黃酮提取率達(dá)4.13%，所對應(yīng)提取物對DPPH·清除率達(dá)92.69% ，是一種適應(yīng)工業(yè)化開發(fā)利用油茶蒲黃酮的理想溶劑。

(2)總黃酮提取率最高的油茶蒲提取物所對應(yīng)的DPPH·清除能力并不是最強(qiáng)的，說明油茶蒲提取物中的抗氧化成分除了黃酮以外，還有其他值得開發(fā)利用的抗氧化活性成分(如多酚、皂素、多糖)，說明油茶蒲具有良好的開發(fā)利用價值。