限制性酶解對豆粉相關性質的影響

于愛華，范志軍，陳 龍，郭長慶，李 波，王冬梅

(黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，黑龍江 佳木斯 154007)

豆粉是大豆經過烘烤粉碎并加入一定量的添加劑制成的粉末狀大豆制品[1]。豆粉不僅具有較高營養價值，而且食用方便，是目前受大眾歡迎的方便速食豆制品。但是豆粉中含有致敏性的物質，限制了豆粉的發展。1995年聯合國糧農組織指出90% 的食物過敏反應是因8類食物引起的，其中大豆位列第四[2]。國際免疫學會聯合會過敏原命名分會官方網站上截至2012年9月24日已批準7類大豆過敏原，分別是Gly m 1(疏水蛋白)、Gly m 2(防御蛋白)、Gly m 3(細胞溶質蛋白)、Gly m 4(病程相關蛋白)、Gly m 5(7S球蛋白)、Gly m 6(11S球蛋白)、Gly m 7(種子生物素化蛋白)。其中Gly m 1和Gly m 3分別包括兩個過敏原亞型；Gly m 5包括7S球蛋白α、α′、β亞基以及β亞基亞型；Gly m 6包括11S球蛋白G1、G2、G3、G4、G5亞基；Gly m 2、Gly m 4、Gly m 7尚未發現過敏原亞型。大豆過敏原相對分子質量范圍為7～76.2 kD[3]。

大豆中含有多種成分的過敏原，使得大豆脫敏成為了目前研究的熱點以及難點。現有的脫敏技術主要包括物理方法、化學方法和生物酶法。其中物理方法主要包括加熱、輻照、高強度超聲波等技術，通過改變蛋白質的構象，進而改變蛋白質的致敏性[4]。化學方法主要有糖基化作用和化學試劑法，通過加入糖類物質(果糖、甘露糖等)可以對大豆的一些致敏原進行掩蔽，從而降低大豆的致敏性，但化學試劑的殘留會對人體產生損害[5]。生物酶法是利用酶對大豆進行酶解，使大豆中的蛋白質發生降解，產生小分子的肽類，從而起到降低大豆致敏性的作用。酶解作用不僅可以降低豆粉的致敏性，而且對豆粉的功能特性也有一定的影響，合適的酶制劑以及適度的酶解是決定豆粉口感、功能特性以及致敏性的重要因素。本文選用木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶酶解豆粉，之后通過噴霧干燥技術制備成豆粉，通過測定豆粉的致敏性、表面疏水性、乳化活性及乳化穩定性等指標，探究酶解時間以及酶制劑種類對豆粉功能特性的影響，為酶解技術應用于豆粉的生產過程提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

北大荒豆粉，北大荒綠色健康食品有限責任公司；大豆，哈爾濱九三油脂集團；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶，北京索萊寶生物科技有限公司；NaHCO3，山東皓宇新材料科技有限公司；麥芽糊精，合肥錦泰糖業有限公司；Lowry試劑盒，南京賽泓瑞生物科技有限公司；電泳試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司；大豆7S球蛋白ELISA試劑盒，江蘇晶美生物科技有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸鹽(ANS)、5,5′ -二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)、三硝基苯磺酸(TNBS)，美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

LNK-871型凱氏定氮儀；SC-3614臥式離心機；DHG-905385-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱；UV-2600 紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；SDS-PAGE電泳儀；XDF-D高速分散器；DJ13B-C652SG豆漿機；PHS-3C雷磁pH計；JE502電子天平；79-1 磁力加熱攪拌器；噴霧干燥機，上海比朗儀器制造有限公司；F-4500熒光分光光度計，日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆粉的制備

大豆在80℃下烘焙20 min，將烘焙大豆與水按1∶7的料液比磨漿，在磨漿的過程中加入適量的NaHCO3以除去豆腥味，豆漿在4 500 r/min、20℃下離心15 min，除去豆渣后，對剩余豆漿進行酶解處理(酶解用酶及相應的酶解條件見表1)，酶解后在90℃下滅酶3 min，然后與配料混合、均質，在進風溫度140℃、出風溫度90℃下噴霧干燥得到成品豆粉。

表1 酶解用酶及相應的酶解條件

1.2.2 豆粉水解度的測定

參照Adler-Nissen[6]的方法測定。

1.2.3 SDS-PAGE電泳分析

豆粉樣品用正己烷進行脫脂處理，參照Jiang等[7]的方法進行SDS-PAGE電泳分析。配制15%和5%的分離膠和濃縮膠，12 mg/mL 的脫脂豆粉溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中(pH 7.4)，加入10 μL上樣緩沖溶液，沸水浴90 s，用80 V的電壓跑濃縮膠，120 V的電壓跑分離膠，之后用考馬斯亮藍進行染色，甲醇-乙酸混合液進行脫色。在凝膠成像儀上觀察凝膠樣品。

1.2.4 豆粉致敏原含量測定

稱取1 g豆粉樣品置于離心管中，加入19 mL過敏原提取液，混合均勻，放置于搖床中，室溫振蕩12 h，然后于3 000×g、室溫離心20 min，取上清液。將上清液過0.45 μm膜，然后用緩沖液稀釋20倍作為待測樣品。利用ELISA法，采用大豆7S球蛋白ELISA試劑盒對豆粉致敏原含量進行測定。

1.2.5 豆粉溶解性的測定

稱取一定量的待測樣品溶于去離子水中，使豆粉質量濃度為2 mg/mL，室溫下攪拌30 min后，在4℃下離心30 min(12 000×g)，用Lowry法測定上清液中的蛋白質含量，根據樣品中蛋白質含量和溶液中蛋白質含量計算NSI。

1.2.6 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法[8]測定豆粉中蛋白質的表面疏水性。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液逐步稀釋至豆粉質量濃度在0.04～0.2 mg/mL之間。取不同質量濃度的稀釋樣品2 mL，在390 nm激發波長和470 nm發射波長條件下分別測定樣品的熒光強度(FI0)和樣品加入10 μL ANS溶液(8 mmol/L)后的熒光強度(FI1)，FI1和FI0的差值即為FI，以蛋白質質量濃度為橫坐標，FI為縱坐標作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質的表面疏水性指數，記為S0。

1.2.7 乳化活性和乳化穩定性的測定

豆粉樣品按1∶10的料液比分散于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，混合均勻后，加入5 mL玉米油，用高速分散器在10 000 r/min下均質1 min，從測試管底部取出50 μL乳化液，用0.1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液按1∶100的體積比稀釋，500 nm波長處測其吸光度(A500)[9]。所有操作最少做3次平行[10]。乳化活性指數(EAI)和乳化穩定性指數(ESI)的計算公式如下。

式中：DF為稀釋因子(100)；c為初始豆粉質量濃度，g/mL；?為光程(0.01)；θ為形成乳化液的油的體積分數(0.25)；A0和A10分別為在0 min和10 min時測得的稀釋后乳化液的吸光度。

1.2.8 豆粉感官評價

10名專業的感官評價人員對在不同條件下生產的豆粉，分別從色澤、顆粒大小、味道以及溶解性方面進行感官評價。

1.2.9 數據分析

每組實驗均進行3次平行實驗，并將實驗數據進行誤差分析。用SPSS 20對數據進行分析，用Origin 8.5制圖。

2 結果與討論

2.1 豆粉水解度(見圖1)

圖1 不同條件下豆粉的水解度

水解度是評判豆粉酶解程度的重要指標。從圖1可知，隨著酶解時間的延長，豆粉的水解度明顯增加(P<0.05)，這可能是由于隨著酶解時間的延長，豆粉中暴露出更多的酶切位點，促進了酶解的進行，增加了豆粉的水解度。從圖1也可以發現，木瓜蛋白酶的水解度明顯(P<0.05)大于風味蛋白酶和堿性蛋白酶，這可能是因為木瓜蛋白酶的酶活較高[11]，因而酶解程度更大，還可能是豆粉中的蛋白質對木瓜蛋白酶的特異性結合遠大于風味蛋白酶和堿性蛋白酶，因而采用木瓜蛋白酶酶解得到的豆粉的水解度更高。

2.2 豆粉中蛋白質的相對分子質量分布(見圖2)

豆粉致敏性成分主要為7S、11S和疏水性蛋白等[3]，7S和11S占豆粉中蛋白質的70%，因此降低豆粉中7S和11S的含量在一定程度上能夠降低豆粉的致敏性。從圖2可知，利用3種蛋白酶酶解的豆粉與市售的北大荒豆粉相比，7S和11S條帶變淺，說明酶解作用能夠降低豆粉中7S和11S的含量，同時也產生了小分子的肽類，這可能是因為酶解作用將豆粉中的大分子蛋白質降解為小分子的肽類。隨著酶解時間的延長，11S的A、B亞基含量逐漸降低，主要是因為隨著酶解時間的延長，豆粉中蛋白質的酶解程度逐漸增加[12]。這一結果與Meinlschmidt等[13]研究的酶解法可以降低豆粉的致敏性結論相一致。由此可以說明酶解作用可以降低豆粉的致敏性。另外，從圖2也可以看出，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶都可將大分子的蛋白質降解為小分子的蛋白質或肽類，與風味蛋白酶相比，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對豆粉的特異性較高。

注：Marker為標準蛋白；I為市售豆粉；F10、F20、F30為風味蛋白酶分別酶解10、20、30 min所得豆粉；M10、M20、M30為木瓜蛋白酶分別酶解10、20、30 min所得豆粉；J10、J20為堿性蛋白酶分別酶解10、20 min所得豆粉。

圖2 不同條件下豆粉中蛋白質的相對分子質量分布

2.3 豆粉致敏原含量(見圖3)

圖3 不同條件下豆粉的致敏原含量

從圖3可知，隨著酶解時間的延長，豆粉的致敏原含量逐漸降低，利用木瓜蛋白酶酶解30 min的豆粉致敏原含量最低，為1.95%。這可能是由于酶解作用將豆粉中大分子蛋白質降解為小分子的肽類，使得豆粉中的致敏性蛋白發生降解，從而降低了豆粉中致敏原的含量。該結果與白小娟[14]的研究結論一致。在相同的酶解時間下，采用木瓜蛋白酶酶解的豆粉致敏原含量低于其他2種蛋白酶的，這可能是由于采用木瓜蛋白酶酶解豆粉的水解度較高，酶解程度大，導致致敏原的含量較低。

2.4 豆粉的溶解性(見圖4)

圖4 不同條件下豆粉的溶解性

由圖4可知，隨著酶解時間的延長，豆粉的溶解性呈現顯著增加的趨勢，這可能是因為隨著酶解時間的延長，酶與底物接觸得更充分，酶解反應更徹底，增加了豆粉的溶解性。利用木瓜蛋白酶酶解30 min的豆粉溶解性最大，NSI為88.55%。這一結果與夏明敬[15]的研究結果一致。在相同酶解時間(10～30 min)下，木瓜蛋白酶酶解得到的豆粉溶解性高于風味蛋白酶和堿性蛋白酶，這是因為蛋白質中有較多的酶切位點與木瓜蛋白酶特異性結合，使得蛋白質酶解得更充分，較大的蛋白質分子發生降解生成小分子的多肽及氨基酸等，小分子的氨基酸和多肽的溶解性更高。

2.5 豆粉中蛋白質的表面疏水性(見圖5)

圖5 不同條件下豆粉中蛋白質的表面疏水性

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，豆粉中蛋白質的表面疏水性逐漸增加，在酶解30 min時達到最大，這可能是由于酶解作用破壞了豆粉中蛋白質間的相互作用，使得蛋白質中更多的疏水區域暴露，增加了蛋白質的表面疏水性，也可能是由于豆粉中蛋白質的結構發生了解折疊的現象，使表面疏水性增加[16]。從圖5也可以看出，在相同酶解時間下蛋白酶的種類對豆粉的表面疏水性沒有顯著的影響。這一研究結果與劉堅[17]的研究一致。

2.6 豆粉乳化活性和乳化穩定性(見圖6)

蛋白質的乳化特性可通過乳化活性指數(EAI)和乳化穩定性指數(ESI)表征[18]。由圖6可知，隨著酶解時間的延長，豆粉的乳化活性和乳化穩定性逐漸增加，利用木瓜蛋白酶酶解30 min得到的豆粉的乳化活性和乳化穩定性最大，分別為182.4 m2/g和120.8 min。這可能是由于延長酶解時間，促進豆粉進一步酶解，豆粉中的蛋白質結構發生改變，使更多的疏水基團暴露，從而增加豆粉的乳化活性及乳化穩定性；同時3種蛋白酶對豆粉的乳化活性及乳化穩定性也有影響，這可能是因為3種酶的作用位點不同，導致豆粉中暴露出不同的氨基酸，改變了豆粉的乳化活性和乳化穩定性。

圖6 不同條件下豆粉的乳化活性及乳化穩定性

2.7 豆粉感官評價(見表2)

表2 豆粉感官評定結果

注：F10、F20、F30為風味蛋白酶分別酶解10、20、30 min所得豆粉；M10、M20、M30為木瓜蛋白酶分別酶解10、20、30 min所得豆粉；J10、J20、J30為堿性蛋白酶分別酶解10、20、30 min所得豆粉。

從表2可以看出，不同條件下制備的豆粉都呈現黃白色，采用堿性蛋白酶酶解得到的豆粉有苦味和澀味，采用風味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解30 min得到的豆粉有微弱的苦味，在其他酶解時間下得到的豆粉有甜味而無苦味，其中木瓜蛋白酶酶解20 min得到的豆粉口感最好，與傳統的豆粉口感最為相似。與傳統的豆粉相比，利用酶解技術制備的豆粉呈粉末狀，這可能是由于酶解作用降低了豆粉的粒徑，在進行噴霧干燥后，豆粉的粒徑降低，呈粉末狀，與尋崇榮等[19]的研究結果相一致。酶解時間越長，豆粉越容易溶于水，這與2.4中豆粉溶解性的研究結果相一致。

3 結 論

以木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和堿性蛋白酶為限制性酶解用酶制備豆粉，以降低豆粉的致敏性，通過對不同酶解時間下制備的豆粉的相關指標進行測定發現，酶解能夠降低豆粉的致敏性，提高豆粉的溶解性、表面疏水性、乳化活性及乳化穩定性，同時利用木瓜蛋白酶限制性酶解20 min制備的豆粉與傳統豆粉口感一致。