響應面法優化球磨破碎圓紅冬孢酵母細胞工藝條件

陳斯楠，畢生雷，魯 龍，法 明，冉芳靜, 宋玉偉

(1.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南 南陽 473000； 2.河南天冠企業集團有限公司車用生物燃料技術國家重點試驗室，河南 南陽 473000)

隨著能源需求量的逐年上升，化石燃料逐漸呈現枯竭的趨勢，生物柴油的開發以及應用引起了人們越來越多的關注。產油微生物自20世紀50年代以來一直是人們研究的熱點，主要由于其具有生長周期短，不需要大面積的生產用地，胞內油脂含量高以及油脂品質優良等優點，可作為生物柴油的原料來源，因此成為替代化石能源，解決能源危機的一個十分有潛力的研究方向[1-2]。

圓紅冬孢酵母屬擔子菌門，胞內油脂含量可達生物量的60%～70%。該菌種不但可以利用廉價的菊芋、秸稈替代葡萄糖作為原料，而且可以在酒精廢水中進行發酵，不僅培養成本低廉，還具有一定的環保發展潛力[3-4]。但該菌種擁有較為堅固的細胞壁，而且細胞壁上附著有大量的β-1,3-葡甘露聚糖，因此細胞破碎的難度相對較大，探究細胞破碎方法也就顯得格外重要[5]。目前，細胞的破碎方法主要分為物理法、化學法和生物酶解法，物理球磨法作為一種高效的細胞破碎方法，操作簡便穩定，設備價格較低，維護成本低廉，破碎率可控制，易放大，不影響油脂結構，符合清潔能源生產理念，在實驗室和工業規模上已得到應用，適用于絕大多數微生物細胞[6-7]。因此，本文探究物理球磨法對圓紅冬孢酵母細胞的破碎效果，優化細胞破碎工藝條件，以期為圓紅冬孢酵母油脂的開發利用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

圓紅冬孢酵母發酵液：河南天冠企業集團試驗中心提供，由圓紅冬孢酵母使用葡萄糖、蛋白胨等原料發酵所得，圓紅冬孢酵母由中科院大連化物所提供，發酵終點生物量為117 g/L、pH為6.3，發酵結束后經100℃ 滅菌備用[8]。無水乙醇、正己烷，均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設備有限公司；烘箱，上海森信試驗儀器有限公司；ME3002E電子天平，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；R-215旋轉蒸發儀，瑞士Buchi公司；高速離心機，長沙英泰儀器有限公司；BCD-215KCM海爾冰箱，青島海爾股份有限公司；行星式球磨機，長沙天創粉末技術有限公司；硅酸鋯珠(65)，致磨(上海)新材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 圓紅冬孢酵母細胞的破碎

取30 mL發酵液，在7 000 r/min下離心5 min收集菌體，加入去離子水洗滌2次，于105℃烘至恒重。將烘干后的酵母干粉加水配制成150 g/L的溶液，每個球磨罐裝載300 mL的酵母液及適量的研磨介質。由于對一定的細胞存在適宜的微珠粒徑，而酵母細胞的最佳破碎直徑為0.2～0.7 mm，因此本試驗采用0.5 mm的介質進行試驗[9]。每個對稱位置的球磨罐的總質量保證相等，隨后將罐體密封放入機器中卡緊，設定球磨機轉速、旋轉方向、研磨時間等參數。球磨罐通過高速轉動，帶動介質在罐體中劇烈攪動，球磨珠與細胞之間的碰撞力與剪切力作用于細胞壁，使得細胞壁破碎釋放油脂[10]。

1.2.2 油脂得率測定

在破碎后的酵母液中加入100 mL正己烷和30 mL無水乙醇，振蕩搖勻，在7 000 r/min下離心10 min，棄去殘渣，將上清液轉入分液漏斗中，同樣的方法重復3次，將得到的上清液合并至分液漏斗中，取有機溶劑層于旋轉蒸發儀中以60℃、3 kPa的條件將有機溶劑與水去除[11-12]，得到油脂。按下式計算油脂得率。

油脂得率=旋轉蒸發后的油脂質量/酵母干粉質量×100%

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 研磨介質對破碎結果的影響

設置球磨機轉速為300 r/min，研磨時間為3 h，介質添加量(以酵母液體積計，下同)為50%，采用不同介質研磨，破碎結束后，提取分離油脂，計算油脂得率，結果如圖1所示。

圖1 不同研磨介質對油脂得率的影響

由圖1可知，在相同條件下玻璃珠的效率最低，原因是玻璃珠的物理結構導致其容易破碎，在高轉速的球磨機中玻璃珠承受不住較高的離心力，在試驗過程中玻璃珠碎珠的現象嚴重，不但影響破碎效率，并且對溶液造成污染。由于分離困難因此會對油脂品質造成極大的影響，工業放大后這些缺點會更加突出，影響工藝的經濟性。而鋼珠與硅酸鋯珠價格相仿，但硅酸鋯珠的效率較高，從經濟和效率上來看工業生產選擇硅酸鋯珠作為介質所帶來的經濟效益會更高。因此，采用硅酸鋯珠作為研磨介質。

2.1.2 研磨時間對破碎結果的影響

設置球磨機轉速為300 r/min，介質添加量為50%，研磨時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，破碎結束后，提取分離油脂，計算油脂得率，結果如圖2所示。

圖2 不同研磨時間對油脂得率的影響

由圖2可知，2.5 h之前油脂得率與研磨時間大致呈線性增長關系，2.5 h后油脂得率增長明顯緩慢，說明此時的細胞已經基本完成破碎。因此，選擇2.5 h作為最佳研磨時間。

2.1.3 球磨機轉速對破碎結果的影響

設置研磨時間為2.5 h，介質添加量為50%，球磨機轉速分別為100、150、200、250、300、350、400、450、500 r/min，破碎結束后，提取分離油脂，計算油脂得率，結果如圖3所示。

圖3 不同球磨機轉速對油脂得率的影響

由圖3可知，球磨機轉速在350 r/min以下時油脂得率與球磨機轉速大致呈線性增長關系，當轉速達到350 r/min時，油脂得率達到最大值，超過該轉速后，油脂得率有所下降。這是因為當球磨機轉速處于較低水平時，轉速越高對細胞的破碎作用越強，但是轉速過高時，由于離心力太大的緣故會使酵母細胞過于分散且研磨介質離散運動的幅度會減小導致剪切力變小，從而降低破壁效果[13]。因此，選擇350 r/min作為最佳球磨機轉速。

2.1.4 介質添加量對破碎結果的影響

設置研磨時間為2.5 h，球磨機轉速為350 r/min，介質添加量分為10%、20%、30%、40%、50%、60%，破碎結束后，提取分離油脂，計算油脂得率，結果如圖4所示。

圖4 不同介質添加量對油脂得率的影響

由圖4可知，介質添加量為40%時油脂得率最高。這是因為過多的介質參與會導致罐體內體積變小，介質之間以及介質與罐體的作用力會增加，反而降低了對細胞的剪切力[14]。因此，選取40%作為最佳介質添加量。

2.2 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，結合實際條件，選取硅酸鋯珠作為研磨介質，應用Design-Expert軟件，根據Box-Behnken中心組合試驗設計方案，以研磨時間(X1)、球磨機轉速(X2)、介質添加量(X3)為影響因素，油脂得率(Y)為響應值，進行三因素三水平響應面試驗，分別進行17組試驗，每個試驗做3個重復，并對試驗結果進行回歸和優化。響應面試驗因素水平見表1，響應面試驗設計及結果見表2，方差分析及顯著性檢驗見表3。

表1 因素水平

表2 響應面試驗設計及結果

表3 方差分析及顯著性檢驗

注： **表示差異極顯著(p<0.01)；*表示差異顯著(p<0.05)。

通過軟件計算可以得到響應值在試驗區中有一個穩定的點(1.00，0.16，0.03)，實際值為研磨時間3 h、球磨機轉速358 r/min、介質添加量40.3%。分析可知這是一個極大值點，從而確定該值即為本試驗的最佳工藝參數。

2.3 驗證試驗

根據實際情況將最佳工藝參數調整為研磨時間3 h、球磨機轉速360 r/min、介質添加量41%，經過5次重復試驗得到平均油脂得率為57.83%。基于成本經濟性的考量，將研磨時間縮短至2.5 h，經過試驗驗證平均油脂得率為57.32%，縮短了17%的研磨時間并且對油脂得率的影響較小。因此，確定最佳工藝條件為研磨時間2.5 h、球磨機轉速360 r/min、介質添加量41%。

3 結 論

通過單因素試驗考察了研磨介質、研磨時間、球磨機轉速、介質添加量對圓紅冬孢酵母細胞壁破碎的影響，通過響應面分析法，確定最佳的工藝條件為：研磨介質為硅酸鋯珠，研磨時間2.5 h，球磨機轉速360 r/min，介質添加量41%。在最佳條件下,油脂得率為57.32%。